Широкопольная микроскопия продвигает методы биомедицинских исследований

В микроскопическом мире клеток свет действует как художник, используя разные цвета и оттенки, чтобы нарисовать изысканные детали жизни.играет незаменимую роль в биомедицинских исследованиях благодаря своим уникальным методам освещения и характеристикам визуализацииВ этой статье рассматриваются принципы, ключевые технологии, преимущества, ограничения и применения широкополосной микроскопии, чтобы представить читателям четкую и всеобъемлющую картину.

Широкопольная микроскопия - это фундаментальная техника оптической микроскопии, характеризующаяся равномерным освещением по всему полю зрения, позволяющая наблюдать и изображать образцы.По сравнению с другими методами, такими как конфокальная микроскопия, широкополевая микроскопия значительно отличается по конструкции оптического пути, принципам изображения и области применения.с однородным проекцией света на образец через конденсаторПередаваемый или отражаемый свет затем собирается объективным линзой, чтобы сформировать изображение в окуляре или камере.

Источник света является важным фактором качества изображения широкополосной микроскопии. Ранние системы в основном опирались на газоразрядные лампы, включая ртуть и ксенонные лампы.Технология LED стала основным выбором.

Ртуть-дуговые лампы обеспечивают высокоинтенсивный свет со спектральными пиками в ближнем УФ (313 нм, 334 нм, 365 нм, 405 нм, 436 нм) и зелено-желтых областях (546 нм, 579 нм).Хотя идеально подходит для возбуждения различных флуоресцентных красителей, их неравномерное спектральное распределение, ограниченный срок службы (200-300 часов) и требования к токсичной утилизации представляют недостатки.

Лампы ксеноновой дуги предлагают более непрерывный спектр от УФ до инфракрасного, хотя и с меньшей интенсивностью видимого света, чем ртутные лампы.но они имеют сходные ограничения в отношении производства тепла и удаления опасных веществ.

Светодиоды произвели революцию в микроскопии широкого поля благодаря их исключительной долговечности (десятки тысяч часов), широкому спектральному диапазону (ультрафиолетовый до ближнего инфракрасного диапазона), высокой энергоэффективности, минимальной тепловой производительности,и точные возможности управленияСовременные светодиодные блоки сравниваются с традиционными дуговыми лампами по интенсивности, при этом исключаются периоды разогрева/охлаждения и требуется только начальная калибровка.Эти преимущества сделали светодиоды доминирующим выбором для широкополосной флуоресцентной микроскопии.

Эти оптические компоненты вместе определяют качество и разрешение изображения.пока конденсатор равномерно освещает образец.

Ключевые параметры включают числовую диафрагму (NA, регулирующую разрешение и яркость), увеличение, рабочее расстояние и коррекцию аберрации.Типы линз варьируются от ахроматных (коррекция двух цветов) до апохроматных (коррекция трех или более цветов) и плановых целей (коррекция кривизны поля).

Конденсаторы, расположенные под образцом, фокусируют и равномерно распределяют свет..Для оптимальной производительности НА конденсатора должен соответствовать НА объектива.

Широкополевая микроскопия включает в себя несколько методов изображения, каждый из которых улучшает контрастность с помощью различных оптических принципов:

Простейший метод, при котором свет проходит прямо через образец. Контраст возникает из-за дифференциального поглощения/рассеивания света,что делает его подходящим для окрашенных образцов, но неэффективным для прозрачных образцов.

Преобразует фазовые изменения, вызванные изменениями показателя преломления, в изменения амплитуды, показывая прозрачные структуры, как живые клетки, без окрашивания.

Использует поляризованное помехи света для создания трехмерных теневых изображений, идеально подходит для наблюдения за живыми клетками и тканевыми участками.

Использует флуоресцентные красители для маркировки конкретных структур.Наиболее распространены эпифлуоресцентные конфигурации (с использованием объектива как для освещения, так и для сбора света), в то время как установки трансмиссионной флуоресценции находят нишевые применения в стоматологических исследованиях и визуализации in vivo.

Камеры с зарядно-связанным устройством (CCD) предлагают высокую чувствительность и низкий уровень шума, но ограниченные частоты кадров.Дополнительные полупроводниковые камеры с оксидом металла (CMOS) обеспечивают более высокую скорость и меньшее потребление энергииНаучные камеры CMOS (sCMOS) объединяют оба преимущества для высококачественных приложений.

Они увеличивают изображение объектива для визуального наблюдения, обычно предлагая увеличение в 10 или 20 раз.

• Более низкая стоимость и более простое обслуживание
• Легкость эксплуатации
• Большое поле зрения
• Быстрая скорость изображения для динамических процессов

• Дифракционно-ограниченное разрешение (~ 200 нм)
• Высокий фон от нефокусного света
• Фотобеливание от освещения целого образца

Широкополевая микроскопия служит различным биомедицинским областям:

Изучение морфологии клеток, распределения органелл и динамических процессов, таких как деление и апоптоз.

Локализация белка и анализ экспрессии генов.

Нейронные морфологические исследования и мониторинг активности с помощью кальциевой визуализации.

Исследование тканевого участка и иммуногистохимическое выявление.

Чтобы преодолеть ограничения широкополосной микроскопии, исследователи разработали передовые альтернативы:

Использует лазерное сканирование и отверстия для удаления нефокусного света, производя оптические секции высокого разрешения.

Инфракрасное возбуждение позволяет глубже проникать в ткани с уменьшенной фототоксичностью.

Превышает пределы дифракции с помощью таких методов, как STED, SIM и методы локализации одной молекулы.

Широкополосные изображения часто требуют улучшения посредством:

• Вычитание фона
• Деконвольсия (остряние с помощью анализа функций точечного распространения)
• Сегментация (идентификация региона для количественного определения)

Измеряет молекулярную динамику путем отслеживания восстановления флуоресценции после отбеливания, с широкополосными версиями, предлагающими более быструю визуализацию и более низкую фототоксичность, чем конфокальный FRAP.

Такие методы, как dSTORM и GSDIM, позволяют решать наноразмеры на широкополосных системах, контролируя состояния переключения фторфоров.

Как основополагающая техника оптической микроскопии, широкополевая микроскопия продолжает играть жизненно важную роль в научных исследованиях.,Оптики, методы визуализации и вычислительный анализ гарантируют его постоянную актуальность для раскрытия биологических тайн.