Les avancées de la microscopie par immersion brisent les barrières de résolution

Vous êtes-vous déjà demandé pourquoi une goutte d'huile ou d'eau est placée entre l'objectif et l'échantillon lors de l'observation du monde microscopique ? Il ne s'agit pas d'un acte aléatoire, mais d'une technique délibérée pour surmonter les limites inhérentes aux microscopes optiques, nous permettant de voir des détails plus fins qui resteraient autrement invisibles. Cet article explore les principes, les applications et les considérations pratiques de la technologie des objectifs à immersion, vous permettant de maîtriser la microscopie à fort grossissement et de découvrir les secrets du monde microscopique.

Les microscopes optiques ne sont pas parfaits. Lors de l'observation d'échantillons à fort grossissement, plusieurs facteurs entrent en jeu, notamment la résolution, l'ouverture numérique (AN), la distance de travail et l'indice de réfraction du milieu. La résolution détermine notre capacité à distinguer les détails fins d'un échantillon, tandis que l'ouverture numérique représente la capacité de la lentille à collecter la lumière. En termes simples, plus l'ouverture numérique est élevée, meilleure est la résolution et plus l'image est claire.

Cependant, l'air a un indice de réfraction relativement faible (environ 1,0). Lorsque la lumière passe d'une lamelle de verre à indice de réfraction élevé à l'air, elle se réfracte et se disperse de manière significative. Cette lumière diffusée ne peut pas être collectée par l'objectif, ce qui réduit la luminosité et la clarté de l'image et limite la résolution. C'est là que la technologie des objectifs à immersion fait une différence critique.

Le principe de base des objectifs à immersion réside dans l'utilisation d'un milieu spécialisé — généralement de l'huile, de l'eau ou du glycérol — pour combler l'espace entre la lentille frontale de l'objectif et l'échantillon. Ce milieu a un indice de réfraction plus proche de celui du verre (environ 1,5), ce qui réduit la réfraction et la diffusion à l'interface entre les différents matériaux. En conséquence, plus de lumière est collectée par l'objectif, ce qui augmente l'ouverture numérique et la résolution.

Imaginez la lumière comme de l'eau qui coule dans des canaux. Lorsque l'eau passe d'un canal (verre) à un autre (air), des turbulences et une diffusion se produisent en raison de la différence de hauteur (mésappariement de l'indice de réfraction). En utilisant une « pompe » (le milieu d'immersion) pour relier les deux canaux, les turbulences sont minimisées et le flux devient plus régulier. Cette analogie capture l'essence du fonctionnement des milieux d'immersion.

Plus précisément, les milieux d'immersion améliorent la qualité de l'imagerie en :

• Réduction de la réfraction de la lumière : Minimiser la réfraction aux interfaces, permettant à plus de lumière d'entrer dans l'objectif.
• Augmentation de la collecte de la lumière : Augmenter l'ouverture numérique pour capturer la lumière sous des angles plus larges.
• Amélioration de la résolution : Améliorer la clarté et les détails de l'image, permettant l'observation de structures plus petites.

Pour obtenir une imagerie optimale, un « système d'immersion homogène » doit être construit. Cela implique de faire correspondre les indices de réfraction et les ouvertures numériques de la lentille frontale de l'objectif, du milieu d'immersion, de la lamelle/lame, du milieu de montage et de la lentille du condenseur aussi étroitement que possible.

• Objectif : Sélectionnez-en un avec une ouverture numérique élevée et une compatibilité avec le milieu d'immersion choisi.
• Milieu d'immersion : Choisissez l'huile, l'eau ou le glycérol approprié en fonction du type d'objectif.
• Lamelle/lame : Utilisez du verre de haute qualité avec des propriétés de réfraction uniformes.
• Milieu de montage : Sélectionnez un milieu avec un indice de réfraction similaire à celui du milieu d'immersion pour minimiser la diffusion.
• Condenseur : Bien que les milieux d'immersion soient rarement utilisés ici, un alignement et des réglages appropriés sont cruciaux pour un contraste et un éclairage optimaux.

En construisant un système d'immersion homogène, la perte de lumière pendant la transmission est minimisée, ce qui donne des images nettes et lumineuses.

Différents milieux d'immersion sont sélectionnés en fonction de l'application et du type d'objectif. Les options les plus courantes incluent l'huile, l'eau et le glycérol, chacune ayant des propriétés et des utilisations distinctes.

Les objectifs à immersion à l'huile sont les plus largement utilisés, généralement pour les observations à fort grossissement. L'indice de réfraction de l'huile correspond étroitement à celui du verre, ce qui améliore considérablement l'ouverture numérique et la résolution. Cependant, leur utilisation nécessite une attention particulière à plusieurs facteurs :

• Sélectionnez la bonne huile : Utilisez toujours l'huile d'immersion recommandée par le fabricant. Évitez les huiles de bois de cèdre plus anciennes, car elles durcissent et endommagent les lentilles. Les huiles synthétiques modernes offrent une meilleure stabilité et des performances optiques.
• Contrôlez la température : L'indice de réfraction de l'huile change avec la température, il est donc essentiel de maintenir un environnement stable (généralement 23 °C).
• Utilisez de l'huile à faible autofluorescence : Pour la microscopie à fluorescence, des huiles spéciales avec une autofluorescence minimale empêchent les interférences avec les signaux.
• Utilisation appropriée : Commencez par un grossissement inférieur pour localiser la zone cible, puis passez à l'objectif à immersion à l'huile après avoir placé une goutte d'huile sur la lamelle. Après utilisation, nettoyez rapidement la lentille pour éviter les résidus.

Les objectifs à immersion à l'eau sont idéaux pour l'imagerie en direct des cellules en raison de leur faible toxicité et de leurs plus longues distances de travail. Ils se présentent en deux variantes :

• Objectifs à immersion à l'eau : Utilisés de la même manière que les objectifs à immersion à l'huile, mais avec de l'eau au lieu de l'huile.
• Objectifs à trempage dans l'eau : Immergés directement dans l'eau ou les milieux aqueux, offrant des distances de travail étendues pour l'observation des cellules dans les boîtes de culture.

Avantages :

• Facile à utiliser et à nettoyer, car l'eau est facilement disponible.
• Faible toxicité pour les cellules vivantes, offrant un environnement plus naturel.
• Pas besoin d'huiles d'immersion spécialisées.

Inconvénients :

• Résolution légèrement inférieure par rapport aux objectifs à immersion à l'huile.
• Sensible aux vibrations et aux courants d'air en raison de la faible viscosité de l'eau.
• Coût plus élevé pour les modèles avancés.

Stratégies d'atténuation :

• Utilisez des tables antivibrations pour minimiser les perturbations.
• Utilisez des anneaux d'eau pour créer des mini-bassins stables sur les lamelles.
• Pour l'imagerie prolongée des cellules vivantes, utilisez des micro-distributeurs pour reconstituer l'eau qui s'évapore.

Ceux-ci conviennent aux échantillons montés dans des milieux à base de glycérol (par exemple, Mowiol, Vectashield), qui ont des indices de réfraction proches d'un mélange glycérol/eau à 80 %/20 % (IR=1,45).

La distance de travail fait référence à l'espace entre la lentille frontale de l'objectif et la lamelle lorsque l'échantillon est mis au point. Elle est inversement corrélée au grossissement — par exemple, un objectif 10x peut avoir une distance de travail de 4 mm, tandis qu'un objectif à immersion à l'huile 100x offre généralement 0,13 mm. Certains objectifs à immersion à l'eau fournissent jusqu'à 3 mm. Cette valeur est souvent marquée sur le corps de l'objectif par « WD ».

Étant donné que l'épaisseur de la lamelle affecte la réfraction de la lumière, les objectifs haut de gamme sont dotés de bagues de correction pour ajuster l'optique interne. Ces bagues rotatives compensent les variations d'épaisseur de la lamelle. Certains modèles avancés offrent même des bagues motorisées contrôlées par logiciel, minimisant les perturbations des échantillons et des configurations d'imagerie.

Les objectifs à immersion sont indispensables dans la recherche biomédicale, en particulier pour l'imagerie en direct des cellules et la microscopie confocale.

• Imagerie en direct des cellules : Les objectifs à immersion à l'eau sont préférés pour leur biocompatibilité et leurs plus longues distances de travail. Certains modèles intègrent le contrôle de la température et du gaz pour maintenir des conditions cellulaires optimales.
• Microscopie confocale : La faible viscosité de l'eau réduit la tension superficielle sur les lamelles, minimisant le déplacement de l'échantillon pendant le balayage de l'axe Z. Ainsi, les objectifs à immersion à l'eau sont standard dans les systèmes confocaux.

La sélection d'un objectif à immersion implique d'évaluer le type d'échantillon, la méthode d'imagerie, la résolution souhaitée et la distance de travail. L'immersion à l'huile excelle dans les observations à haute résolution, l'immersion à l'eau convient aux études sur les cellules vivantes et l'immersion au glycérol fonctionne le mieux avec les échantillons montés au glycérol. La compréhension de ces outils libère tout le potentiel de la microscopie, révélant les merveilles cachées de l'univers microscopique.

En résumé, les objectifs à immersion sont des composants essentiels des microscopes optiques, améliorant la résolution et la qualité de l'image en minimisant la réfraction de la lumière et en maximisant la collecte de la lumière. La maîtrise de leurs principes et de leurs applications est essentielle pour les chercheurs qui explorent les frontières de la science biomédicale.