Postępy w mikroskopii immersyjnej przełamują bariery rozdzielczości

Czy kiedykolwiek zastanawiałeś się, dlaczego kropla oleju lub wody umieszczana jest między obiektywem a próbką podczas obserwacji mikroskopowego świata? To nie przypadek, ale celowa technika mająca na celu pokonanie wrodzonych ograniczeń mikroskopów optycznych, pozwalająca nam dostrzec drobniejsze szczegóły, które w przeciwnym razie pozostałyby niewidoczne. Ten artykuł bada zasady, zastosowania i praktyczne aspekty technologii obiektywów immersyjnych, umożliwiając opanowanie mikroskopii o wysokim powiększeniu i odkrycie tajemnic mikroskopijnego świata.

Mikroskopy optyczne nie są doskonałe. Podczas obserwacji próbek przy dużym powiększeniu w grę wchodzi kilka czynników, w tym rozdzielczość, apertura numeryczna (NA), odległość robocza i współczynnik załamania ośrodka. Rozdzielczość określa naszą zdolność do rozróżniania drobnych szczegółów w próbce, podczas gdy apertura numeryczna reprezentuje zdolność soczewki do zbierania światła. Mówiąc prościej, im wyższa apertura numeryczna, tym lepsza rozdzielczość i jaśniejszy obraz.

Jednak powietrze ma stosunkowo niski współczynnik załamania (około 1,0). Kiedy światło przechodzi z szkiełka nakrywkowego o wysokim współczynniku załamania do powietrza, ulega znacznemu załamaniu i rozproszeniu. To rozproszone światło nie może być zbierane przez obiektyw, co zmniejsza jasność i przejrzystość obrazu oraz ogranicza rozdzielczość. Właśnie tutaj technologia obiektywów immersyjnych robi krytyczną różnicę.

Podstawową zasadą obiektywów immersyjnych jest użycie specjalnego medium — zwykle oleju, wody lub glicerolu — do wypełnienia szczeliny między przednią soczewką obiektywu a próbką. To medium ma współczynnik załamania zbliżony do szkła (około 1,5), zmniejszając załamanie i rozpraszanie na granicy między różnymi materiałami. W rezultacie więcej światła jest zbierane przez obiektyw, zwiększając aperturę numeryczną i rozdzielczość.

Wyobraź sobie światło jako wodę płynącą przez kanały. Kiedy woda przemieszcza się z jednego kanału (szkło) do drugiego (powietrze), dochodzi do turbulencji i rozpraszania z powodu różnicy wysokości (niedopasowanie współczynnika załamania). Używając „pompy” (medium immersyjnego) do połączenia dwóch kanałów, turbulencje są minimalizowane, a przepływ staje się płynniejszy. Ta analogia oddaje istotę działania mediów immersyjnych.

W szczególności media immersyjne poprawiają jakość obrazowania poprzez:

• Redukcję załamania światła: Minimalizację załamania na granicach, umożliwiając wejście większej ilości światła do obiektywu.
• Zwiększenie zbierania światła: Zwiększenie apertury numerycznej w celu przechwytywania światła z szerszych kątów.
• Poprawę rozdzielczości: Zwiększenie przejrzystości i szczegółowości obrazu, umożliwiając obserwację mniejszych struktur.

Aby uzyskać optymalne obrazowanie, należy zbudować „homogeniczny system immersyjny”. Obejmuje to dopasowanie współczynników załamania i apertury numerycznej przedniej soczewki obiektywu, medium immersyjnego, szkiełka nakrywkowego/szkiełka podstawowego, medium montażowego i soczewki kondensora tak blisko, jak to możliwe.

• Soczewka obiektywu: Wybierz taką o wysokiej aperturze numerycznej i kompatybilności z wybranym medium immersyjnym.
• Medium immersyjne: Wybierz odpowiedni olej, wodę lub glicerol w oparciu o typ obiektywu.
• Szkiełko nakrywkowe/szkiełko podstawowe: Używaj wysokiej jakości szkła o jednolitych właściwościach załamania.
• Medium montażowe: Wybierz medium o współczynniku załamania zbliżonym do medium immersyjnego, aby zminimalizować rozpraszanie.
• Kondensor: Chociaż media immersyjne są tu rzadko używane, odpowiednie ustawienie i ustawienia są kluczowe dla optymalnego kontrastu i oświetlenia.

Budując homogeniczny system immersyjny, minimalizuje się straty światła podczas transmisji, co daje ostre i jasne obrazy.

Różne media immersyjne są wybierane w oparciu o zastosowanie i typ obiektywu. Najczęstsze opcje to olej, woda i glicerol, każdy z odrębnymi właściwościami i zastosowaniami.

Obiektywy immersyjne olejowe są najczęściej używane, zwykle do obserwacji przy dużym powiększeniu. Współczynnik załamania oleju ściśle odpowiada współczynnikowi szkła, co znacznie poprawia aperturę numeryczną i rozdzielczość. Jednak ich użycie wymaga zwrócenia uwagi na kilka czynników:

• Wybierz odpowiedni olej: Zawsze używaj oleju immersyjnego zalecanego przez producenta. Unikaj starszych olejków cedrowych, ponieważ twardnieją i uszkadzają soczewki. Nowoczesne oleje syntetyczne oferują lepszą stabilność i wydajność optyczną.
• Kontroluj temperaturę: Współczynnik załamania oleju zmienia się wraz z temperaturą, dlatego utrzymanie stabilnego środowiska (zazwyczaj 23°C) jest niezbędne.
• Używaj oleju o niskiej autofluorescencji: W mikroskopii fluorescencyjnej specjalne oleje o minimalnej autofluorescencji zapobiegają interferencji z sygnałami.
• Właściwe użytkowanie: Zacznij od mniejszego powiększenia, aby zlokalizować obszar docelowy, a następnie przełącz się na obiektyw immersyjny olejowy po umieszczeniu kropli oleju na szkiełku nakrywkowym. Po użyciu natychmiast wyczyść soczewkę, aby uniknąć pozostałości.

Obiektywy immersyjne wodne są idealne do obrazowania żywych komórek ze względu na ich niską toksyczność i dłuższe odległości robocze. Występują w dwóch wariantach:

• Obiektywy immersyjne wodne: Używane podobnie do obiektywów immersyjnych olejowych, ale z wodą zamiast oleju.
• Obiektywy do zanurzania w wodzie: Zanurzane bezpośrednio w wodzie lub mediach wodnych, oferując wydłużone odległości robocze do obserwacji komórek w naczyniach hodowlanych.

Zalety:

• Łatwe w użyciu i czyszczeniu, ponieważ woda jest łatwo dostępna.
• Niska toksyczność dla żywych komórek, zapewniająca bardziej naturalne środowisko.
• Brak potrzeby stosowania specjalnych olejów immersyjnych.

Wady:

• Nieco niższa rozdzielczość w porównaniu z obiektywami immersyjnymi olejowymi.
• Podatność na wibracje i prądy powietrzne ze względu na niską lepkość wody.
• Wyższy koszt zaawansowanych modeli.

Strategie łagodzenia:

• Używaj stołów antywibracyjnych, aby zminimalizować zakłócenia.
• Używaj pierścieni wodnych, aby tworzyć stabilne mini-baseny na szkiełkach nakrywkowych.
• Do długotrwałego obrazowania żywych komórek używaj mikro-dozowników do uzupełniania parującej wody.

Są one odpowiednie dla próbek zamontowanych w mediach na bazie glicerolu (np. Mowiol, Vectashield), które mają współczynniki załamania zbliżone do mieszaniny 80%/20% glicerol/woda (RI=1,45).

Odległość robocza odnosi się do szczeliny między przednią soczewką obiektywu a szkiełkiem nakrywkowym, gdy próbka jest w ostrości. Jest odwrotnie skorelowana z powiększeniem — np. obiektyw 10x może mieć odległość roboczą 4 mm, podczas gdy obiektyw immersyjny olejowy 100x zwykle oferuje 0,13 mm. Niektóre obiektywy immersyjne wodne zapewniają do 3 mm. Ta wartość jest często oznaczona na tubusie obiektywu jako „WD”.

Ponieważ grubość szkiełka nakrywkowego wpływa na załamanie światła, wysokiej klasy obiektywy posiadają kołnierze korekcyjne do regulacji optyki wewnętrznej. Te obrotowe pierścienie kompensują zmiany grubości szkiełka nakrywkowego. Niektóre zaawansowane modele oferują nawet zmotoryzowane kołnierze sterowane za pomocą oprogramowania, minimalizując zakłócenia próbek i konfiguracji obrazowania.

Obiektywy immersyjne są niezbędne w badaniach biomedycznych, szczególnie do obrazowania żywych komórek i mikroskopii konfokalnej.

• Obrazowanie żywych komórek: Obiektywy immersyjne wodne są preferowane ze względu na ich biokompatybilność i dłuższe odległości robocze. Niektóre modele integrują kontrolę temperatury i gazu, aby utrzymać optymalne warunki komórkowe.
• Mikroskopia konfokalna: Niska lepkość wody zmniejsza napięcie powierzchniowe na szkiełkach nakrywkowych, minimalizując przemieszczanie się próbki podczas skanowania w osi Z. Dlatego obiektywy immersyjne wodne są standardem w systemach konfokalnych.

Wybór obiektywu immersyjnego obejmuje ocenę typu próbki, metody obrazowania, pożądanej rozdzielczości i odległości roboczej. Immersja olejowa wyróżnia się w obserwacjach o wysokiej rozdzielczości, immersja wodna pasuje do badań żywych komórek, a immersja glicerolowa najlepiej sprawdza się z próbkami montowanymi w glicerolu. Zrozumienie tych narzędzi uwalnia pełny potencjał mikroskopii, ujawniając ukryte cuda mikroskopijnego wszechświata.

Podsumowując, obiektywy immersyjne są istotnymi elementami mikroskopów optycznych, podnoszącymi rozdzielczość i jakość obrazu poprzez minimalizację załamania światła i maksymalizację zbierania światła. Opanowanie ich zasad i zastosowań jest niezbędne dla naukowców poruszających się po granicach nauk biomedycznych.