没入型顕微鏡技術の進歩が分解能の限界を突破

顕微鏡の世界を観察する際に、なぜ油や水滴を対物レンズとサンプルとの間に置くのか疑問に思ったことはありませんか？これは単なる偶然ではなく、光学顕微鏡に内在する限界を克服するための意図的な技術であり、そうでなければ見えない微細な詳細を観察することを可能にします。この記事では、浸漬対物レンズ技術の原理、応用、および実用的な考慮事項を探求し、高倍率顕微鏡を習得し、微視的領域の秘密を解き明かすための力を与えます。

光学顕微鏡は完璧ではありません。高倍率でサンプルを観察する場合、分解能、開口数（NA）、作動距離、および媒体の屈折率など、いくつかの要因が作用します。分解能は、サンプル内の微細な詳細を区別する能力を決定し、開口数はレンズの集光能力を表します。簡単に言えば、開口数が高いほど分解能が向上し、画像が鮮明になります。

しかし、空気の屈折率は比較的低いです（約1.0）。屈折率の高いガラスカバーガラスから空気に光が通過すると、著しく屈折し散乱します。この散乱光は対物レンズで集光できず、画像の明るさと鮮明さを低下させ、分解能を制限します。ここで、浸漬対物レンズ技術が決定的な違いを生み出します。

浸漬対物レンズの核心的な原理は、通常は油、水、またはグリセロールである特殊な媒体を使用して、対物レンズの前面レンズとサンプルの間のギャップを埋めることにあります。この媒体はガラスの屈折率（約1.5）に近いため、異なる材料間の界面での屈折と散乱を低減します。その結果、より多くの光が対物レンズによって集光され、開口数と分解能が向上します。

光を水がチャネルを流れるように想像してください。水が1つのチャネル（ガラス）から別のチャネル（空気）に移動すると、高さの違い（屈折率のミスマッチ）により、乱れと散乱が発生します。「ポンプ」（浸漬媒体）を使用して2つのチャネルを橋渡しすることで、乱れが最小限に抑えられ、流れがよりスムーズになります。このアナロジーは、浸漬媒体がどのように機能するかの本質を捉えています。

具体的には、浸漬媒体は次の方法で画像品質を向上させます。

• 光の屈折の低減： 界面での屈折を最小限に抑え、より多くの光が対物レンズに入るようにします。
• 光の収集の増加： 開口数を上げて、より広い角度からの光を捉えます。
• 分解能の向上： 画像の鮮明さと詳細さを向上させ、より小さな構造の観察を可能にします。

最適な画像を得るには、「均質浸漬システム」を構築する必要があります。これには、対物レンズの前面レンズ、浸漬媒体、カバーガラス/スライド、マウント媒体、およびコンデンサーレンズの屈折率と開口数をできるだけ近づけることが含まれます。

• 対物レンズ： 高い開口数と、選択した浸漬媒体との互換性を持つものを選択します。
• 浸漬媒体： 対物レンズの種類に基づいて、適切な油、水、またはグリセロールを選択します。
• カバーガラス/スライド： 均一な屈折特性を持つ高品質のガラスを使用します。
• マウント媒体： 散乱を最小限に抑えるために、浸漬媒体と屈折率が類似している媒体を選択します。
• コンデンサー： ここでは浸漬媒体が使用されることはめったにありませんが、最適なコントラストと照明を得るためには、適切な調整と設定が不可欠です。

均質浸漬システムを構築することにより、透過中の光の損失が最小限に抑えられ、鮮明で明るい画像が得られます。

さまざまな浸漬媒体は、用途と対物レンズの種類に基づいて選択されます。最も一般的なオプションには、油、水、およびグリセロールがあり、それぞれに異なる特性と用途があります。

油浸対物レンズは最も広く使用されており、通常は高倍率の観察に使用されます。油の屈折率はガラスの屈折率に近いため、開口数と分解能が大幅に向上します。ただし、その使用にはいくつかの要因に注意が必要です。

• 適切な油を選択する： 必ずメーカーが推奨する浸漬油を使用してください。古いシダーウッドオイルは硬化してレンズを損傷するため、避けてください。最新の合成油は、より優れた安定性と光学性能を提供します。
• 温度を制御する： 油の屈折率は温度によって変化するため、安定した環境（通常は23℃）を維持することが不可欠です。
• 低自己蛍光油を使用する： 蛍光顕微鏡検査では、自己蛍光を最小限に抑えた特殊なオイルを使用して、信号への干渉を防ぎます。
• 適切な使用法： 低倍率から始めてターゲット領域を見つけ、カバーガラスに油を1滴落とした後、油浸対物レンズに切り替えます。使用後は、残留物を避けるためにレンズを速やかに清掃してください。

水浸対物レンズは、低毒性と長い作動距離のため、ライブセルイメージングに最適です。これらには2つのバリアントがあります。

• 水浸対物レンズ： 油浸対物レンズと同様に使用しますが、油の代わりに水を使用します。
• 水浸漬対物レンズ： 水または水性媒体に直接浸漬し、培養皿内の細胞を観察するための長い作動距離を提供します。

利点：

• 水が容易に入手できるため、使いやすく、清掃が簡単です。
• 生細胞に対する毒性が低く、より自然な環境を提供します。
• 特殊な浸漬油は不要です。

欠点：

• 油浸対物レンズと比較して、分解能がわずかに低い。
• 水の粘度が低いため、振動や気流の影響を受けやすい。
• 高度なモデルではコストが高くなります。

軽減策：

• 振動を最小限に抑えるために、防振テーブルを使用します。
• カバーガラス上に安定したミニプールを作成するために、ウォーターリングを使用します。
• 長時間のライブセルイメージングには、蒸発する水を補充するためにマイクロディスペンサーを使用します。

これらは、グリセロールベースの媒体（例：Mowiol、Vectashield）にマウントされたサンプルに適しており、80％/ 20％グリセロール/水混合物（RI = 1.45）に近い屈折率を持っています。

作動距離とは、サンプルが焦点にあるときの対物レンズの前面レンズとカバーガラスの間のギャップを指します。これは倍率と反比例します。たとえば、10倍の対物レンズは4 mmの作動距離を持つことがありますが、100倍の油浸レンズは通常0.13 mmを提供します。一部の水浸対物レンズは最大3 mmを提供します。この値は、対物レンズバレルに「WD」としてマークされることがよくあります。

カバーガラスの厚さは光の屈折に影響するため、ハイエンドの対物レンズには、内部光学系を調整するための補正カラーが備わっています。これらの回転可能なリングは、カバーガラスの厚さの変動を補正します。一部の高度なモデルでは、ソフトウェアを介して制御される電動カラーも提供されており、サンプルとイメージング設定への影響を最小限に抑えます。

浸漬対物レンズは、生体医学研究、特にライブセルイメージングと共焦点顕微鏡に不可欠です。

• ライブセルイメージング： 水浸対物レンズは、その生体適合性と長い作動距離から好まれます。一部のモデルは、最適な細胞条件を維持するために温度とガス制御を統合しています。
• 共焦点顕微鏡： 水の低粘度は、カバーガラスの表面張力を低減し、Z軸スキャン中のサンプルの変位を最小限に抑えます。したがって、水浸対物レンズは、共焦点システムでは標準です。

浸漬対物レンズを選択するには、サンプルの種類、イメージング方法、必要な分解能、および作動距離を評価する必要があります。油浸は高解像度の観察に優れており、水浸はライブセル研究に適しており、グリセロール浸はグリセロールマウントされたサンプルに最適です。これらのツールを理解することで、顕微鏡の可能性を最大限に引き出し、微視的宇宙の隠された驚異を明らかにすることができます。

要約すると、浸漬対物レンズは光学顕微鏡の重要なコンポーネントであり、光の屈折を最小限に抑え、光の収集を最大化することにより、分解能と画像品質を向上させます。その原理と応用を習得することは、生体医学科学の最前線をナビゲートする研究者にとって不可欠です。