I progressi della microscopia a immersione abbattono le barriere della risoluzione

Vi siete mai chiesti perché una goccia di olio o acqua viene posta tra l'obiettivo e il campione quando si osserva il mondo microscopico? Non si tratta di un atto casuale, ma di una tecnica deliberata per superare i limiti intrinseci dei microscopi ottici, che ci permette di vedere dettagli più fini che altrimenti rimarrebbero invisibili. Questo articolo esplora i principi, le applicazioni e le considerazioni pratiche della tecnologia a immersione, consentendovi di padroneggiare la microscopia ad alto ingrandimento e scoprire i segreti del regno microscopico.

I microscopi ottici non sono perfetti. Quando si osservano campioni ad alto ingrandimento, entrano in gioco diversi fattori, tra cui la risoluzione, l'apertura numerica (NA), la distanza di lavoro e l'indice di rifrazione del mezzo. La risoluzione determina la nostra capacità di distinguere i dettagli fini in un campione, mentre l'apertura numerica rappresenta la capacità della lente di raccogliere la luce. In parole povere, maggiore è l'apertura numerica, migliore è la risoluzione e più chiara è l'immagine.

Tuttavia, l'aria ha un indice di rifrazione relativamente basso (circa 1,0). Quando la luce passa da un vetrino coprioggetto in vetro ad alto indice di rifrazione all'aria, si rifrange e si disperde in modo significativo. Questa luce diffusa non può essere raccolta dall'obiettivo, riducendo la luminosità e la chiarezza dell'immagine e limitando la risoluzione. È qui che la tecnologia a immersione fa la differenza in modo critico.

Il principio fondamentale degli obiettivi a immersione risiede nell'utilizzo di un mezzo specializzato, tipicamente olio, acqua o glicerolo, per riempire lo spazio tra la lente frontale dell'obiettivo e il campione. Questo mezzo ha un indice di rifrazione più vicino a quello del vetro (circa 1,5), riducendo la rifrazione e la dispersione all'interfaccia tra materiali diversi. Di conseguenza, l'obiettivo raccoglie più luce, aumentando l'apertura numerica e la risoluzione.

Immaginate la luce come acqua che scorre attraverso dei canali. Quando l'acqua si sposta da un canale (vetro) a un altro (aria), si verificano turbolenze e dispersione a causa della differenza di altezza (mancata corrispondenza dell'indice di rifrazione). Utilizzando una "pompa" (il mezzo a immersione) per collegare i due canali, le turbolenze vengono ridotte al minimo e il flusso diventa più regolare. Questa analogia cattura l'essenza di come funzionano i mezzi a immersione.

Nello specifico, i mezzi a immersione migliorano la qualità dell'immagine:

• Riducendo la rifrazione della luce: Minimizzando la rifrazione alle interfacce, consentendo a più luce di entrare nell'obiettivo.
• Aumentando la raccolta della luce: Aumentando l'apertura numerica per catturare la luce da angolazioni più ampie.
• Migliorando la risoluzione: Migliorando la chiarezza e i dettagli dell'immagine, consentendo l'osservazione di strutture più piccole.

Per ottenere un'imaging ottimale, è necessario costruire un "sistema a immersione omogeneo". Ciò implica l'abbinamento degli indici di rifrazione e delle aperture numeriche della lente frontale dell'obiettivo, del mezzo a immersione, del vetrino coprioggetto/vetrino portaoggetti, del mezzo di montaggio e della lente del condensatore nel modo più preciso possibile.

• Lente dell'obiettivo: Selezionare una lente con un'elevata apertura numerica e compatibilità con il mezzo a immersione scelto.
• Mezzo a immersione: Scegliere l'olio, l'acqua o il glicerolo appropriati in base al tipo di obiettivo.
• Vetrino coprioggetto/vetrino portaoggetti: Utilizzare vetro di alta qualità con proprietà di rifrazione uniformi.
• Mezzo di montaggio: Selezionare un mezzo con un indice di rifrazione simile a quello del mezzo a immersione per ridurre al minimo la dispersione.
• Condensatore: Sebbene i mezzi a immersione siano raramente utilizzati qui, l'allineamento e le impostazioni corrette sono fondamentali per un contrasto e un'illuminazione ottimali.

Costruendo un sistema a immersione omogeneo, la perdita di luce durante la trasmissione è ridotta al minimo, producendo immagini nitide e luminose.

I diversi mezzi a immersione vengono selezionati in base all'applicazione e al tipo di obiettivo. Le opzioni più comuni includono olio, acqua e glicerolo, ciascuno con proprietà e usi distinti.

Gli obiettivi a immersione in olio sono i più utilizzati, in genere per osservazioni ad alto ingrandimento. L'indice di rifrazione dell'olio corrisponde strettamente a quello del vetro, migliorando significativamente l'apertura numerica e la risoluzione. Tuttavia, il loro utilizzo richiede attenzione a diversi fattori:

• Selezionare l'olio giusto: Utilizzare sempre l'olio a immersione consigliato dal produttore. Evitare i vecchi oli di legno di cedro, poiché si induriscono e danneggiano le lenti. Gli oli sintetici moderni offrono una migliore stabilità e prestazioni ottiche.
• Controllare la temperatura: L'indice di rifrazione dell'olio cambia con la temperatura, quindi è essenziale mantenere un ambiente stabile (in genere 23°C).
• Utilizzare olio a bassa autofluorescenza: Per la microscopia a fluorescenza, oli speciali con autofluorescenza minima impediscono l'interferenza con i segnali.
• Uso corretto: Iniziare con un ingrandimento inferiore per individuare l'area target, quindi passare all'obiettivo a immersione in olio dopo aver posto una goccia di olio sul vetrino coprioggetto. Dopo l'uso, pulire immediatamente la lente per evitare residui.

Gli obiettivi a immersione in acqua sono ideali per l'imaging di cellule vive grazie alla loro bassa tossicità e alle maggiori distanze di lavoro. Sono disponibili in due varianti:

• Obiettivi a immersione in acqua: Utilizzati in modo simile agli obiettivi a immersione in olio, ma con acqua invece di olio.
• Obiettivi a immersione a immersione: Immersi direttamente in acqua o in mezzi acquosi, offrendo distanze di lavoro estese per l'osservazione delle cellule in piastre di coltura.

Vantaggi:

• Facili da usare e da pulire, poiché l'acqua è facilmente disponibile.
• Bassa tossicità per le cellule vive, fornendo un ambiente più naturale.
• Nessuna necessità di oli a immersione specializzati.

Svantaggi:

• Risoluzione leggermente inferiore rispetto agli obiettivi a immersione in olio.
• Suscettibili alle vibrazioni e alle correnti d'aria a causa della bassa viscosità dell'acqua.
• Costo più elevato per i modelli avanzati.

Strategie di mitigazione:

• Utilizzare tavoli antivibrazioni per ridurre al minimo le perturbazioni.
• Impiegare anelli d'acqua per creare mini-piscine stabili sui vetrini coprioggetto.
• Per l'imaging prolungato di cellule vive, utilizzare micro-erogatori per ripristinare l'acqua evaporata.

Questi sono adatti per campioni montati in mezzi a base di glicerolo (ad es. Mowiol, Vectashield), che hanno indici di rifrazione vicini a una miscela 80%/20% glicerolo/acqua (RI=1,45).

La distanza di lavoro si riferisce allo spazio tra la lente frontale dell'obiettivo e il vetrino coprioggetto quando il campione è a fuoco. È inversamente correlata all'ingrandimento, ad esempio, un obiettivo 10x può avere una distanza di lavoro di 4 mm, mentre una lente a immersione in olio 100x offre in genere 0,13 mm. Alcuni obiettivi a immersione in acqua forniscono fino a 3 mm. Questo valore è spesso indicato sul corpo dell'obiettivo come "WD".

Poiché lo spessore del vetrino coprioggetto influisce sulla rifrazione della luce, gli obiettivi di fascia alta sono dotati di anelli di correzione per regolare l'ottica interna. Questi anelli rotanti compensano le variazioni di spessore del vetrino coprioggetto. Alcuni modelli avanzati offrono persino anelli motorizzati controllati tramite software, riducendo al minimo le interruzioni dei campioni e delle configurazioni di imaging.

Gli obiettivi a immersione sono indispensabili nella ricerca biomedica, in particolare per l'imaging di cellule vive e la microscopia confocale.

• Imaging di cellule vive: Gli obiettivi a immersione in acqua sono preferiti per la loro biocompatibilità e le maggiori distanze di lavoro. Alcuni modelli integrano il controllo della temperatura e del gas per mantenere condizioni cellulari ottimali.
• Microscopia confocale: La bassa viscosità dell'acqua riduce la tensione superficiale sui vetrini coprioggetto, riducendo al minimo lo spostamento del campione durante la scansione sull'asse Z. Pertanto, gli obiettivi a immersione in acqua sono standard nei sistemi confocali.

La selezione di un obiettivo a immersione prevede la valutazione del tipo di campione, del metodo di imaging, della risoluzione desiderata e della distanza di lavoro. L'immersione in olio eccelle nelle osservazioni ad alta risoluzione, l'immersione in acqua è adatta agli studi sulle cellule vive e l'immersione in glicerolo funziona al meglio con campioni montati in glicerolo. La comprensione di questi strumenti sblocca l'intero potenziale della microscopia, rivelando le meraviglie nascoste dell'universo microscopico.

In sintesi, gli obiettivi a immersione sono componenti vitali dei microscopi ottici, che elevano la risoluzione e la qualità dell'immagine riducendo al minimo la rifrazione della luce e massimizzando la raccolta della luce. Padroneggiare i loro principi e le loro applicazioni è essenziale per i ricercatori che navigano nelle frontiere della scienza biomedica.