Достижения иммерсионной микроскопии преодолевают барьеры разрешения

Задумывались ли вы когда-нибудь, почему каплю масла или воды помещают между объективом и образцом при наблюдении микроскопического мира? Это не случайное действие, а преднамеренная техника для преодоления присущих оптическим микроскопам ограничений, позволяющая нам видеть более мелкие детали, которые в противном случае остались бы невидимыми. В этой статье рассматриваются принципы, применение и практические соображения технологии иммерсионных объективов, что позволит вам освоить микроскопию с высоким увеличением и раскрыть секреты микроскопического мира.

Оптические микроскопы не идеальны. При наблюдении образцов с высоким увеличением в игру вступают несколько факторов, включая разрешение, числовую апертуру (NA), рабочее расстояние и показатель преломления среды. Разрешение определяет нашу способность различать мелкие детали в образце, в то время как числовая апертура представляет собой способность линзы собирать свет. Проще говоря, чем выше числовая апертура, тем лучше разрешение и четче изображение.

Однако воздух имеет относительно низкий показатель преломления (приблизительно 1,0). Когда свет проходит от покровного стекла с высоким показателем преломления в воздух, он значительно преломляется и рассеивается. Этот рассеянный свет не может быть собран объективом, что снижает яркость и четкость изображения и ограничивает разрешение. Именно здесь технология иммерсионных объективов имеет решающее значение.

Основной принцип иммерсионных объективов заключается в использовании специализированной среды — обычно масла, воды или глицерина — для заполнения зазора между передней линзой объектива и образцом. Эта среда имеет показатель преломления, близкий к показателю преломления стекла (приблизительно 1,5), что уменьшает преломление и рассеяние на границе раздела между различными материалами. В результате объектив собирает больше света, увеличивая числовую апертуру и разрешение.

Представьте себе свет как воду, текущую по каналам. Когда вода переходит из одного канала (стекло) в другой (воздух), возникают турбулентность и рассеяние из-за разницы в высоте (несоответствие показателя преломления). Используя «насос» (иммерсионную среду) для соединения двух каналов, турбулентность сводится к минимуму, а поток становится более плавным. Эта аналогия отражает суть работы иммерсионных сред.

В частности, иммерсионные среды улучшают качество изображения за счет:

• Уменьшения преломления света: Минимизации преломления на границах раздела, позволяющей большему количеству света попадать в объектив.
• Увеличения сбора света: Повышения числовой апертуры для захвата света с более широких углов.
• Улучшения разрешения: Повышения четкости и детализации изображения, позволяющей наблюдать более мелкие структуры.

Для достижения оптимального изображения необходимо построить «однородную иммерсионную систему». Это включает в себя максимально точное соответствие показателей преломления и числовых апертур передней линзы объектива, иммерсионной среды, покровного стекла/предметного стекла, среды для крепления и линзы конденсатора.

• Объектив: Выберите объектив с высокой числовой апертурой и совместимостью с выбранной иммерсионной средой.
• Иммерсионная среда: Выберите подходящее масло, воду или глицерин в зависимости от типа объектива.
• Покровное стекло/предметное стекло: Используйте высококачественное стекло с однородными свойствами преломления.
• Монтажная среда: Выберите среду с показателем преломления, аналогичным показателю преломления иммерсионной среды, чтобы минимизировать рассеяние.
• Конденсор: Хотя иммерсионные среды редко используются здесь, правильное выравнивание и настройки имеют решающее значение для оптимальной контрастности и освещения.

Построив однородную иммерсионную систему, потери света во время передачи сводятся к минимуму, что дает четкие и яркие изображения.

Различные иммерсионные среды выбираются в зависимости от области применения и типа объектива. Наиболее распространенные варианты включают масло, воду и глицерин, каждый из которых обладает особыми свойствами и применением.

Масляные иммерсионные объективы наиболее широко используются, как правило, для наблюдений с высоким увеличением. Показатель преломления масла почти соответствует показателю преломления стекла, что значительно улучшает числовую апертуру и разрешение. Однако их использование требует внимания к нескольким факторам:

• Выберите правильное масло: Всегда используйте иммерсионное масло, рекомендованное производителем. Избегайте старых кедровых масел, так как они затвердевают и повреждают линзы. Современные синтетические масла обеспечивают лучшую стабильность и оптические характеристики.
• Контролируйте температуру: Показатель преломления масла меняется с температурой, поэтому поддержание стабильной среды (обычно 23°C) имеет важное значение.
• Используйте масло с низкой аутофлуоресценцией: Для флуоресцентной микроскопии используются специальные масла с минимальной аутофлуоресценцией, чтобы предотвратить помехи сигналам.
• Правильное использование: Начните с меньшего увеличения, чтобы найти целевую область, затем переключитесь на масляный иммерсионный объектив после нанесения капли масла на покровное стекло. После использования немедленно очистите линзу, чтобы избежать остатков.

Водные иммерсионные объективы идеально подходят для визуализации живых клеток из-за их низкой токсичности и большего рабочего расстояния. Они бывают двух вариантов:

• Водные иммерсионные объективы: Используются аналогично масляным иммерсионным объективам, но с водой вместо масла.
• Объективы для погружения в воду: Погружаются непосредственно в воду или водные среды, обеспечивая увеличенное рабочее расстояние для наблюдения за клетками в чашках Петри.

Преимущества:

• Простота использования и очистки, так как вода легко доступна.
• Низкая токсичность для живых клеток, обеспечивающая более естественную среду.
• Отсутствие необходимости в специализированных иммерсионных маслах.

Недостатки:

• Несколько более низкое разрешение по сравнению с масляными иммерсионными объективами.
• Подверженность вибрациям и воздушным потокам из-за низкой вязкости воды.
• Более высокая стоимость для передовых моделей.

Стратегии смягчения последствий:

• Используйте антивибрационные столы, чтобы минимизировать помехи.
• Используйте водяные кольца для создания стабильных мини-бассейнов на покровных стеклах.
• Для длительной визуализации живых клеток используйте микродозаторы для пополнения испаряющейся воды.

Они подходят для образцов, смонтированных в средах на основе глицерина (например, Mowiol, Vectashield), которые имеют показатели преломления, близкие к смеси 80%/20% глицерина/воды (RI=1,45).

Рабочее расстояние относится к зазору между передней линзой объектива и покровным стеклом, когда образец находится в фокусе. Оно обратно пропорционально увеличению — например, объектив 10x может иметь рабочее расстояние 4 мм, в то время как масляный иммерсионный объектив 100x обычно обеспечивает 0,13 мм. Некоторые водные иммерсионные объективы обеспечивают до 3 мм. Это значение часто указывается на корпусе объектива как «WD».

Поскольку толщина покровного стекла влияет на преломление света, высококачественные объективы оснащены коррекционными кольцами для регулировки внутренней оптики. Эти вращающиеся кольца компенсируют изменения толщины покровного стекла. Некоторые передовые модели даже предлагают моторизованные кольца, управляемые с помощью программного обеспечения, сводя к минимуму нарушения образцов и настроек визуализации.

Иммерсионные объективы незаменимы в биомедицинских исследованиях, особенно для визуализации живых клеток и конфокальной микроскопии.

• Визуализация живых клеток: Водные иммерсионные объективы предпочтительны из-за их биосовместимости и большего рабочего расстояния. Некоторые модели интегрируют контроль температуры и газа для поддержания оптимальных условий для клеток.
• Конфокальная микроскопия: Низкая вязкость воды уменьшает поверхностное натяжение на покровных стеклах, сводя к минимуму смещение образца во время сканирования по оси Z. Таким образом, водные иммерсионные объективы являются стандартными в конфокальных системах.

Выбор иммерсионного объектива включает в себя оценку типа образца, метода визуализации, желаемого разрешения и рабочего расстояния. Масляная иммерсия превосходна при наблюдениях с высоким разрешением, водная иммерсия подходит для исследований живых клеток, а глицериновая иммерсия лучше всего работает с образцами, смонтированными в глицерине. Понимание этих инструментов раскрывает весь потенциал микроскопии, раскрывая скрытые чудеса микроскопической вселенной.

В заключение, иммерсионные объективы являются жизненно важными компонентами оптических микроскопов, повышающими разрешение и качество изображения за счет минимизации преломления света и максимизации сбора света. Освоение их принципов и применений необходимо для исследователей, работающих на передовых рубежах биомедицинской науки.