Avances en microscopía de inmersión rompen barreras de resolución

¿Alguna vez se ha preguntado por qué se coloca una gota de aceite o agua entre el objetivo y la muestra al observar el mundo microscópico? Este no es un acto aleatorio, sino una técnica deliberada para superar las limitaciones inherentes de los microscopios ópticos, lo que nos permite ver detalles más finos que de otro modo permanecerían invisibles. Este artículo explora los principios, aplicaciones y consideraciones prácticas de la tecnología de objetivos de inmersión, lo que le permite dominar la microscopía de alta magnificación y descubrir los secretos del reino microscópico.

Los microscopios ópticos no son perfectos. Al observar muestras a alta magnificación, entran en juego varios factores, incluida la resolución, la apertura numérica (NA), la distancia de trabajo y el índice de refracción del medio. La resolución determina nuestra capacidad para distinguir detalles finos en una muestra, mientras que la apertura numérica representa la capacidad de la lente para recolectar luz. En pocas palabras, cuanto mayor sea la apertura numérica, mejor será la resolución y más clara será la imagen.

Sin embargo, el aire tiene un índice de refracción relativamente bajo (aproximadamente 1,0). Cuando la luz pasa de una cubreobjetos de vidrio de alto índice de refracción al aire, se refracta y se dispersa significativamente. Esta luz dispersa no puede ser recolectada por el objetivo, lo que reduce el brillo y la claridad de la imagen y limita la resolución. Aquí es donde la tecnología de objetivos de inmersión marca una diferencia crítica.

El principio fundamental de los objetivos de inmersión radica en el uso de un medio especializado, típicamente aceite, agua o glicerol, para llenar el espacio entre la lente frontal del objetivo y la muestra. Este medio tiene un índice de refracción más cercano al del vidrio (aproximadamente 1,5), lo que reduce la refracción y la dispersión en la interfaz entre diferentes materiales. Como resultado, el objetivo recolecta más luz, lo que aumenta la apertura numérica y la resolución.

Imagine la luz como agua que fluye a través de canales. Cuando el agua se mueve de un canal (vidrio) a otro (aire), se produce turbulencia y dispersión debido a la diferencia de altura (desajuste del índice de refracción). Al usar una "bomba" (el medio de inmersión) para unir los dos canales, la turbulencia se minimiza y el flujo se vuelve más suave. Esta analogía captura la esencia de cómo funcionan los medios de inmersión.

Específicamente, los medios de inmersión mejoran la calidad de la imagen al:

• Reducir la refracción de la luz: Minimizar la refracción en las interfaces, permitiendo que entre más luz en el objetivo.
• Aumentar la recolección de luz: Aumentar la apertura numérica para capturar la luz desde ángulos más amplios.
• Mejorar la resolución: Mejorar la claridad y el detalle de la imagen, lo que permite la observación de estructuras más pequeñas.

Para lograr una imagen óptima, se debe construir un "sistema de inmersión homogéneo". Esto implica hacer coincidir los índices de refracción y las aperturas numéricas de la lente frontal del objetivo, el medio de inmersión, el cubreobjetos/portaobjetos, el medio de montaje y la lente del condensador lo más cerca posible.

• Lente del objetivo: Seleccione uno con una alta apertura numérica y compatibilidad con el medio de inmersión elegido.
• Medio de inmersión: Elija el aceite, agua o glicerol apropiado según el tipo de objetivo.
• Cubreobjetos/portaobjetos: Use vidrio de alta calidad con propiedades de refracción uniformes.
• Medio de montaje: Seleccione un medio con un índice de refracción similar al medio de inmersión para minimizar la dispersión.
• Condensador: Si bien los medios de inmersión rara vez se usan aquí, la alineación y la configuración adecuadas son cruciales para un contraste e iluminación óptimos.

Al construir un sistema de inmersión homogéneo, se minimiza la pérdida de luz durante la transmisión, lo que produce imágenes nítidas y brillantes.

Se seleccionan diferentes medios de inmersión según la aplicación y el tipo de objetivo. Las opciones más comunes incluyen aceite, agua y glicerol, cada uno con distintas propiedades y usos.

Los objetivos de inmersión en aceite son los más utilizados, típicamente para observaciones de alta magnificación. El índice de refracción del aceite coincide estrechamente con el del vidrio, lo que mejora significativamente la apertura numérica y la resolución. Sin embargo, su uso requiere atención a varios factores:

• Seleccione el aceite correcto: Use siempre el aceite de inmersión recomendado por el fabricante. Evite los aceites de madera de cedro más antiguos, ya que se endurecen y dañan las lentes. Los aceites sintéticos modernos ofrecen una mejor estabilidad y rendimiento óptico.
• Control de la temperatura: El índice de refracción del aceite cambia con la temperatura, por lo que es esencial mantener un entorno estable (típicamente 23 °C).
• Use aceite de baja autofluorescencia: Para la microscopía de fluorescencia, los aceites especiales con autofluorescencia mínima evitan la interferencia con las señales.
• Uso adecuado: Comience con una magnificación más baja para ubicar el área objetivo, luego cambie al objetivo de inmersión en aceite después de colocar una gota de aceite en el cubreobjetos. Después del uso, limpie la lente rápidamente para evitar residuos.

Los objetivos de inmersión en agua son ideales para la obtención de imágenes de células vivas debido a su baja toxicidad y mayores distancias de trabajo. Vienen en dos variantes:

• Objetivos de inmersión en agua: Se utilizan de forma similar a los objetivos de inmersión en aceite, pero con agua en lugar de aceite.
• Objetivos de inmersión en agua: Sumergidos directamente en agua o medios acuosos, que ofrecen distancias de trabajo extendidas para observar células en placas de cultivo.

Ventajas:

• Fáciles de usar y limpiar, ya que el agua está fácilmente disponible.
• Baja toxicidad para las células vivas, proporcionando un entorno más natural.
• No se necesitan aceites de inmersión especializados.

Desventajas:

• Resolución ligeramente inferior en comparación con los objetivos de inmersión en aceite.
• Susceptibles a vibraciones y corrientes de aire debido a la baja viscosidad del agua.
• Mayor costo para modelos avanzados.

Estrategias de mitigación:

• Use mesas antivibración para minimizar las perturbaciones.
• Emplee anillos de agua para crear mini-piscinas estables en los cubreobjetos.
• Para la obtención de imágenes de células vivas prolongadas, use micro-dispensadores para reponer el agua que se evapora.

Estos son adecuados para muestras montadas en medios a base de glicerol (por ejemplo, Mowiol, Vectashield), que tienen índices de refracción cercanos a una mezcla de glicerol/agua al 80 %/20 % (IR=1,45).

La distancia de trabajo se refiere al espacio entre la lente frontal del objetivo y el cubreobjetos cuando la muestra está enfocada. Se correlaciona inversamente con la magnificación, por ejemplo, un objetivo de 10x puede tener una distancia de trabajo de 4 mm, mientras que una lente de inmersión en aceite de 100x normalmente ofrece 0,13 mm. Algunos objetivos de inmersión en agua proporcionan hasta 3 mm. Este valor a menudo se marca en el cuerpo del objetivo como "WD".

Dado que el grosor del cubreobjetos afecta la refracción de la luz, los objetivos de alta gama cuentan con collares de corrección para ajustar la óptica interna. Estos anillos giratorios compensan las variaciones en el grosor del cubreobjetos. Algunos modelos avanzados incluso ofrecen collares motorizados controlados a través de software, lo que minimiza las interrupciones en las muestras y las configuraciones de imagen.

Los objetivos de inmersión son indispensables en la investigación biomédica, particularmente para la obtención de imágenes de células vivas y la microscopía confocal.

• Obtención de imágenes de células vivas: Se prefieren los objetivos de inmersión en agua por su biocompatibilidad y mayores distancias de trabajo. Algunos modelos integran el control de temperatura y gas para mantener condiciones celulares óptimas.
• Microscopía confocal: La baja viscosidad del agua reduce la tensión superficial en los cubreobjetos, minimizando el desplazamiento de la muestra durante el escaneo del eje Z. Por lo tanto, los objetivos de inmersión en agua son estándar en los sistemas confocales.

La selección de un objetivo de inmersión implica evaluar el tipo de muestra, el método de imagen, la resolución deseada y la distancia de trabajo. La inmersión en aceite sobresale en las observaciones de alta resolución, la inmersión en agua se adapta a los estudios de células vivas y la inmersión en glicerol funciona mejor con muestras montadas en glicerol. La comprensión de estas herramientas desbloquea todo el potencial de la microscopía, revelando las maravillas ocultas del universo microscópico.

En resumen, los objetivos de inmersión son componentes vitales de los microscopios ópticos, que elevan la resolución y la calidad de la imagen al minimizar la refracción de la luz y maximizar la recolección de luz. Dominar sus principios y aplicaciones es esencial para los investigadores que navegan por las fronteras de la ciencia biomédica.