বিজ্ঞানীরা সংখ্যাগত আলোর দক্ষতার মাধ্যমে মাইক্রোস্কোপিক রেজোলিউশনকে এগিয়ে নিয়ে যান

মাইক্রোস্কোপিক অন্বেষণে, গবেষকরা প্রায়ই একটি হতাশাজনক সীমাবদ্ধতার মুখোমুখি হনঃ এমনকি সর্বোচ্চ বৃহত্তরীকরণেও, সূক্ষ্ম নমুনা বিবরণগুলি অস্পষ্ট থাকে।এই চ্যালেঞ্জটি অপর্যাপ্ত বৃহত্তরীকরণের কারণে নয় বরং অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপির দুটি মূল পরামিতিগুলির দ্বারা চাপিত মৌলিক সীমাবদ্ধতার কারণেএই নিবন্ধটি এই সমালোচনামূলক কারণগুলির মধ্যে সম্পর্ক পরীক্ষা করে এবং মাইক্রোস্কোপের কর্মক্ষমতা সর্বাধিকীকরণের জন্য ব্যবহারিক কৌশলগুলি উপস্থাপন করে।

সংখ্যাসূচক এপারচার একটি অবজেক্টিভ লেন্সের আলোর সংগ্রহ এবং সূক্ষ্ম নমুনার বিবরণ সমাধান করার ক্ষমতাকে পরিমাপ করে, সরাসরি তার কাজের দূরত্বের সাথে সম্পর্কিত।যখন আলো একটি নমুনা মাধ্যমে পাস এবং লক্ষ্য প্রবেশ করে, এটি একটি উল্টানো শঙ্কুযুক্ত মরীচি গঠন করে।

দৃশ্যমান আলোতে 400-700 এনএম এর মধ্যে তরঙ্গদৈর্ঘ্যের বৈদ্যুতিন চৌম্বকীয় তরঙ্গ রয়েছে। রেফারেন্সের জন্য, সবুজ আলো 550 এনএম (0.55 মাইক্রোমিটার) এর আশেপাশে কেন্দ্রীভূত হয়। যখন মাইক্রোস্কোপিক নমুনাগুলি আলোকিত করা হয়,আলোর বিভাজন তার মূল পথ থেকে বিচ্যুতি সৃষ্টি করে. ছোট নমুনাগুলি আরও স্পষ্ট বিভাজন তৈরি করে। উচ্চতর এনএ অবজেক্টগুলি আরও খাড়া কোণে আলো ধারণ করে, সূক্ষ্ম কাঠামো পর্যবেক্ষণের অনুমতি দেয়।

সমান্তরাল আলোকসজ্জা ব্যবহার করে মৌলিক মাইক্রোস্কোপ সিস্টেম (কন্ডেনসার ছাড়া) একটি সীমিত শঙ্কু কোণে আলো সংগ্রহ করে।একটি কনডেন্সার যোগ করে আলোকসজ্জা শঙ্কু তৈরি করে যা লক্ষ্যের আলোর সংগ্রহের কোণের সাথে মেলে), কাজের ডিসপ্লে বাড়ানোর মাধ্যমে সিস্টেমের রেজোলিউশন সর্বাধিকীকরণ √ লক্ষ্য এবং কনডেনসার ডিসপ্লে কোণের যোগফল।

NA সংজ্ঞায়িত করা হয়েছেঃ

NA = η • sin ((α)

যেখানে α হল লেন্সের আভা কোণের অর্ধেক এবং η হল লেন্স এবং কভারস্লিপের মধ্যে নিমজ্জন মাধ্যমের বিচ্ছিন্নতা সূচক (η = 1 বায়ুর জন্য; 1.51 তেল / কাচের জন্য) ।

যেহেতু sin ((α) 1 অতিক্রম করতে পারে না (90 ° এ তাত্ত্বিক সর্বোচ্চ), ব্যবহারিক NA মানগুলি নিমজ্জন মিডিয়াতে ব্যাপকভাবে নির্ভর করে। উচ্চ-কার্যকারিতা লক্ষ্যগুলি সাধারণত 70-80 ° সংগ্রহের কোণ অর্জন করে,যা NA=1 অতিক্রম করার জন্য তেল নিমজ্জন প্রয়োজন.0.

মাইক্রোস্কোপ রেজোলিউশন ন্যূনতম বিচ্ছিন্নতা সংজ্ঞায়িত করে যেখানে দুটি নমুনা পয়েন্ট পৃথক বলে মনে হয়। এই বিচ্ছিন্নতা-সীমাবদ্ধ বৈশিষ্ট্যটি লক্ষ্যবস্তুতে প্রবেশকারী হালকা তরঙ্গ কোণগুলির উপর নির্ভর করে,উচ্চ প্রসারণে রেজোলিউশন কিছুটা বিষয়গত করে তোলে যেখানে ফোকাস অনুভূত বিবরণ প্রভাবিত করে.

যখন বৃহত্তরীকরণ একটি চিত্রের শারীরিক রেজোলিউশনের ক্ষমতা অতিক্রম করে, তখন নতুন বিবরণ প্রকাশ না করে "খালি বৃহত্তরীকরণ" ঘটে।সর্বোত্তম বৃহত্তরীকরণ সাধারণত লক্ষ্যবস্তুর NA মানের 500-1000 গুণের মধ্যে পড়ে.

60-100x লক্ষ্যগুলির মধ্যে নিমজ্জন তেল (η = 1.51) ব্যবহার করে বায়ু-গ্লাস বিচ্ছিন্ন ইন্টারফেসগুলি দূর করে, হালকা ক্ষতি হ্রাস করে এবং NA সর্বাধিক করে।বুদবুদ ছাড়াই সঠিক প্রয়োগ অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ ০ লক্ষ্যবস্তুর পিছনের ফোকাল প্লেন পরীক্ষা করে বুদবুদ সনাক্ত করা যায়.

মাইক্রোস্কোপ অপটিক্স কনসেন্ট্রিক রিং দ্বারা বেষ্টিত Airy ডিস্ক হিসাবে নমুনা পয়েন্ট রেন্ডার₀) এই ধরনের দুটি প্যাটার্নের মধ্যে ব্যবহারিক রেজোলিউশন নির্ধারণ করে।

আর্নস্ট অ্যাবের সমীকরণগুলি রেজোলিউশনের সীমা নির্ধারণ করেঃ

পাশের রেজোলিউশন (x,y) = λ / 2NA

অক্ষীয় রেজোলিউশন (z) = 2λ / NA²

NA=1.40 এর জন্য λ=400 nm এ, এটি ~150 nm পার্শ্বীয় এবং ~400 nm অক্ষীয় রেজোলিউশন সীমা প্রদান করে।

যখন দুটি এয়ারি ডিস্ক তাদের কেন্দ্রীয় সর্বোচ্চগুলি একে অপরের প্রথম সর্বনিম্নের সাথে সারিবদ্ধ হয় (শীর্ষের মধ্যে 20% তীব্রতা ড্রপ), তখন তারা নিম্নলিখিত দ্বারা বর্ণিত রেজোলিউশন থ্রেশহোল্ডে পৌঁছে যায়ঃ

d₀= ১.২২λ / (NA)_{উদ্দেশ্য}+ NA_কন্ড)

শুষ্ক লক্ষ্যগুলির উপর আঙুলের ছাপ বা নিমজ্জন লেন্সে দূষণ আলো ছড়িয়ে দেয়, বিপরীততা হ্রাস করে। লেন্স-গ্রেড ইথানল এবং পোঁদ মুক্ত কাপড় দিয়ে পরিষ্কার করুন।

উচ্চ-এনএ লক্ষ্যমাত্রা (> 0.65) 170 মাইক্রোমিটার কভারস্লিপ প্রয়োজন। যখন লক্ষ্যমাত্রা NA> 0 এ ~ 10 মাইক্রোমিটার বৈচিত্র্য সহ্য করে।7, নিম্ন এনএ লেন্স 30 মাইক্রন বিচ্যুতি সামঞ্জস্য করতে পারে।

NA> 0.95 লক্ষ্যমাত্রার জন্য অ-ফ্লুওরেসেন্ট, পিসিবি মুক্ত নিমজ্জন তেল (η=1.515) ব্যবহার করুন। বুদবুদ মুক্ত প্রয়োগ সর্বোত্তম কর্মক্ষমতা নিশ্চিত করে।