顕微鏡観察において、研究者はしばしばフラストレーションを感じる制限に直面します。それは、最大倍率であっても、微細なサンプルの詳細が不明瞭なまま残るというものです。この課題は、十分な倍率がないからではなく、光学顕微鏡の2つの主要なパラメータ、すなわち数値開口数（NA）と分解能によって課される基本的な制約に起因しています。この記事では、これらの重要な要因間の関係を検証し、顕微鏡の性能を最大化するための実践的な戦略を紹介します。
数値開口数は、対物レンズが光を収集し、微細な標本の詳細を分解する能力を定量化し、その作動距離と直接相関します。光がサンプルを通過して対物レンズに入ると、逆円錐形のビームを形成します。
可視光は、400〜700 nmの波長を持つ電磁波で構成されています。参考までに、緑色の光は550 nm（0.55 µm）付近に中心があります。顕微鏡標本を照射すると、光の回折により元の経路から逸脱します。より小さな標本は、より顕著な回折を生じます。NAの高い対物レンズは、より急な角度で光を捉え、より微細な構造の観察を可能にします。
平行照明を使用する基本的な顕微鏡システム（コンデンサなし）は、限られた円錐角内で光を収集します。コンデンサを追加すると、対物レンズの光収集角度に一致する照明円錐が作成され、作動開口数（対物レンズとコンデンサの開口角の合計）を増加させることで、システムの分解能が最大化されます。
NAは次のように定義されます。
NA = η • sin(α)
ここで、αは対物レンズの開口角の半分を表し、ηはレンズとカバーガラス間の浸漬媒体の屈折率を表します（空気の場合はη = 1、オイル/ガラスの場合は1.51）。
sin(α)は1を超えることができないため（理論上の最大値は90°）、実際のNA値は浸漬媒体に大きく依存します。高性能対物レンズは通常、70〜80°の収集角度を達成し、NA=1.0を超えるにはオイル浸漬が必要です。
顕微鏡の分解能は、2つの標本点が区別して見える最小の間隔を定義します。この回折限界特性は、対物レンズに入る光波の角度に依存するため、焦点が知覚される詳細に影響を与える高倍率では、分解能はいくらか主観的です。
倍率が画像の物理的な分解能能力を超えると、「空の倍率」が発生し、新しい詳細が明らかになりません。最適な倍率は、通常、対物レンズのNA値の500〜1000倍の間です。
60〜100×対物レンズ間で浸漬オイル（η=1.51）を使用すると、空気とガラスの屈折界面が排除され、光の損失が最小限に抑えられ、NAが最大化されます。気泡のない適切な塗布が重要です。気泡は、対物レンズの後部焦点面を調べることで検出できます。
顕微鏡光学系は、標本点をエアリーディスク（同心円で囲まれた回折パターン）としてレンダリングします。このような2つのパターン間の最小分解可能距離（d 0 ）は、実用的な分解能を定義します。
エルンスト・アッベの式は、分解能の限界を定義します。
横方向分解能（x、y）= λ / 2NA
軸方向分解能（z）= 2λ / NA 2
NA=1.40、λ=400 nmの場合、これは約150 nmの横方向と約400 nmの軸方向の分解能限界をもたらします。
2つのエアリーディスクが互いの最初の最小値（ピーク間の20％の強度低下）と中心の最大値が揃うまで近づくと、次のように記述される分解能のしきい値に達します。
d 0 = 1.22λ / (NA Obj + NA Cond )
乾燥した対物レンズの指紋や浸漬レンズの汚染は光を散乱させ、コントラストを低下させます。レンズグレードのエタノールと糸くずの出ない布で清掃してください。
高NA対物レンズ（>0.65）には170 µmのカバーガラスが必要です。NA>0.7では、対物レンズは〜10 µmの変動を許容しますが、NAの低いレンズは30 µmの偏差に対応できます。
NA>0.95の対物レンズには、非蛍光性、PCBフリーの浸漬オイル（η=1.515）を使用してください。気泡のない塗布は、最適なパフォーマンスを保証します。
