Ученые продвигают микроскопическое разрешение с помощью цифрового диафрагмы

При исследовании микроскопическим прибором исследователи часто сталкиваются с разочаровывающим ограничением: даже при максимальном увеличении мелкие детали образца остаются нечеткими.Эта проблема возникает не из-за недостаточного увеличения, а из-за фундаментальных ограничений, налагаемых двумя основными параметрами оптической микроскопииВ этой статье рассматривается взаимосвязь между этими критическими факторами и представлены практические стратегии для максимизации производительности микроскопа.

Численная диафрагма измеряет способность объектива собирать свет и разрешать мелкие детали образца, напрямую коррелируя с его рабочим расстоянием.Когда свет проходит через образец и попадает в объектив, он образует перевернутый конический пучок.

Видимый свет состоит из электромагнитных волн с длиной волны от 400 до 700 нм. Для справки, зеленый свет сосредоточен около 550 нм (0,55 мкм).Дифракция света вызывает отклонение от его первоначального путиБолее высокие объективы NA улавливают свет под более крутыми углами, что позволяет наблюдать более тонкие структуры.

Базовые микроскопические системы, использующие параллельное освещение (без конденсаторов), собирают свет в пределах ограниченного угла конуса.Добавление конденсатора создает конусы освещения, которые соответствуют углу сбора света объектива, максимизируя разрешение системы за счет увеличения рабочей диафрагмы (сумма углов диафрагмы объектива и конденсатора).

NA определяется как:

NA = η • sin ((α)

где α представляет собой половину угла диафрагмы объектива, а η - показатель преломления среды погружения между линзой и крышкой (η = 1 для воздуха; 1,51 для масла/стекла).

Поскольку sin ((α) не может превышать 1 (теоретический максимум при 90°), практические значения NA в значительной степени зависят от среды погружения.требующие погружения в масло, чтобы превысить NA=1.0.

Разрешение микроскопа определяет минимальное разделение, при котором две точки образца выглядят различными.делая разрешение несколько субъективным при больших увеличениях, где фокус влияет на воспринимаемую детальность.

Когда увеличение превышает физическое разрешение изображения, происходит "пустое увеличение", не раскрывая новых деталей.Оптимальное увеличение обычно составляет от 500 до 1000 раз больше значения NA объектива.

Использование масла погружения (η=1.51) между объективами 60-100 раз устраняет рефракционные интерфейсы воздуха и стекла, минимизируя потерю света и максимизируя NA.Правильное применение без пузырей имеет решающее значение. Пузыри можно обнаружить, изучив заднюю фокусную плоскость объектива..

Микроскопическая оптика изображает точки образца как диски Airy, окруженные концентрическими кольцами.₀) между двумя такими моделями определяет практическое решение.

Уравнения Эрнста Аббе определяют пределы разрешения:

Боковое разрешение (x,y) = λ / 2NA

Осяное разрешение (z) = 2λ / NA²

Для NA=1,40 при λ=400 нм это дает ~150 нм боковых и ~400 нм осевых пределов разрешения.

Когда два диска Эри приближаются до тех пор, пока их центральные максимумы не выравниваются с первыми минимумами друг друга (20% снижения интенсивности между пиками), они достигают порога разрешимости, описанного:

d₀= 1,22λ / (NA)_Цель+ NA_{Условия})

Отпечатки пальцев на сухих объективах или загрязнение на линзах для погружения рассеивают свет, уменьшая контраст.

Цели с высоким НА (> 0,65) требуют 170 мкм. В то время как объекты допускают ~ 10 мкм вариации при НА> 0.7, линзы с более низким НА могут вмещать отклонения 30 мкм.

Для целей NA> 0,95 используйте нефлуоресцентное масло для погружения без ПХБ (η=1,515).