वैज्ञानिकों ने संख्यात्मक एपर्चर में महारत हासिल करके माइक्रोस्कोपिक रिज़ॉल्यूशन को आगे बढ़ाया

माइक्रोस्कोपिक अन्वेषण में, शोधकर्ताओं को अक्सर एक निराशाजनक सीमा का सामना करना पड़ता हैः यहां तक कि अधिकतम आवर्धन पर, ठीक नमूने विवरण अस्पष्ट रहते हैं।यह चुनौती अपर्याप्त आवर्धन से नहीं बल्कि ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के दो मुख्य मापदंडों संख्यात्मक एपर्चर (NA) और रिज़ॉल्यूशन द्वारा लगाए गए मौलिक प्रतिबंधों से उत्पन्न होती है।यह लेख इन महत्वपूर्ण कारकों के बीच संबंध की जांच करता है और माइक्रोस्कोप प्रदर्शन को अधिकतम करने के लिए व्यावहारिक रणनीतियों को प्रस्तुत करता है।

संख्यात्मक एपर्चर एक लेंस की प्रकाश एकत्र करने और ठीक नमूने के विवरण को हल करने की क्षमता को मापता है, जो सीधे इसकी कार्य दूरी से संबंधित है।जब प्रकाश एक नमूना से गुजरता है और उद्देश्य में प्रवेश करता है, यह एक उलटा शंकुआकार बीम बनाता है।

दृश्य प्रकाश में विद्युत चुम्बकीय तरंगें होती हैं जिनकी तरंग दैर्ध्य 400-700 एनएम के बीच होती है। संदर्भ के लिए, हरी रोशनी 550 एनएम (0.55 μm) के आसपास केंद्रित होती है।प्रकाश विवर्तन के कारण उसके मूल पथ से विचलन होता हैछोटे नमूनों में अधिक स्पष्ट विवर्तन होता है। उच्च एनए लेंस तेज कोणों पर प्रकाश को कैप्चर करते हैं, जिससे बारीक संरचनाओं का अवलोकन संभव होता है।

समानांतर प्रकाश व्यवस्था (कंडेन्सर के बिना) का उपयोग करने वाली बुनियादी सूक्ष्मदर्शी प्रणालियाँ एक सीमित शंकु कोण के भीतर प्रकाश एकत्र करती हैं।एक कंडेनसर जोड़ने प्रकाश संकेतक कोनों जो उद्देश्य के प्रकाश संग्रह कोण से मेल खाता है बनाता है, अधिकतम सिस्टम रिज़ॉल्यूशन के माध्यम से बढ़ी हुई कामकाजी एपर्चर उद्देश्य और संघनक एपर्चर कोणों का योग।

एनए को परिभाषित किया गया हैः

NA = η • sin ((α)

जहां α लेंस के एपर्चर कोण का आधा हिस्सा है और η लेंस और कवरस्लिप के बीच विसर्जन माध्यम के अपवर्तक सूचकांक को दर्शाता है (η = 1 हवा के लिए; 1.51 तेल/कांच के लिए) ।

चूंकि sin ((α) 1 (90° पर सैद्धांतिक अधिकतम) से अधिक नहीं हो सकता है, इसलिए व्यावहारिक NA मूल्य विसर्जन मीडिया पर बहुत निर्भर करते हैं। उच्च प्रदर्शन वाले उद्देश्य आमतौर पर 70-80° संग्रह कोण प्राप्त करते हैं,NA=1 से अधिक तेल विसर्जन की आवश्यकता.0.

सूक्ष्मदर्शी संकल्प न्यूनतम पृथक्करण को परिभाषित करता है जहां दो नमूना बिंदु अलग दिखाई देते हैं। यह विवर्तन-सीमित गुण उद्देश्य में प्रवेश करने वाले प्रकाश तरंग कोणों पर निर्भर करता है,उच्च आवर्धन पर संकल्प को कुछ हद तक व्यक्तिपरक बनाना जहां फोकस कथित विवरण को प्रभावित करता है.

जब आवर्धन किसी चित्र की भौतिक संकल्प क्षमता से अधिक हो जाता है, तो "खाली आवर्धन" होता है, बिना किसी नए विवरण का खुलासा किए।इष्टतम आवर्धन आमतौर पर ऑब्जेक्टिव के एनए मूल्य के 500-1000 गुना के बीच होता है.

60-100 गुना उद्देश्यों के बीच विसर्जन तेल (η=1.51) का उपयोग करके वायु-ग्लास अपवर्तक इंटरफेस को समाप्त किया जाता है, जिससे प्रकाश हानि कम होती है और एनए को अधिकतम किया जाता है।बुलबुले के बिना उचित आवेदन महत्वपूर्ण है.

माइक्रोस्कोप ऑप्टिक्स, समकक्ष अंगूठियों से घिरे एरी डिस्क के रूप में नमूना बिंदुओं को प्रतिबिंबित करता है।₀) दो ऐसे पैटर्न के बीच व्यावहारिक संकल्प को परिभाषित करता है।

अर्न्स्ट एबे के समीकरण संकल्प सीमाओं को परिभाषित करते हैंः

पार्श्व संकल्प (x,y) = λ / 2NA

अक्षीय संकल्प (z) = 2λ / NA²

λ=400 एनएम पर NA=1.40 के लिए, यह ~150 एनएम पार्श्व और ~400 एनएम अक्षीय रिज़ॉल्यूशन सीमाएं देता है।

जब दो एरी डिस्क एक दूसरे के पहले न्यूनतम के साथ उनके केंद्रीय अधिकतम संरेखित होने तक (20% चरम के बीच तीव्रता की गिरावट) तक पहुंचते हैं, तो वे निम्न द्वारा वर्णित संकल्पनीयता सीमा तक पहुंचते हैंः

d₀= 1.22λ / (NA)_{उद्देश्य}+ एनए_कंड)

सूखे उद्देश्यों पर फिंगरप्रिंट या विसर्जन लेंस पर दूषितता प्रकाश फैलाती है, विपरीत को कम करती है। लेंस-ग्रेड इथेनॉल और फिसलन मुक्त कपड़े के साथ साफ करें।

उच्च एनए लक्ष्य (>0.65) के लिए 170 माइक्रोन कवरस्लिप की आवश्यकता होती है। जबकि लक्ष्य एनए> 0 पर ~ 10 माइक्रोन भिन्नता को सहन करते हैं।7, निम्न एनए लेंस 30 μm विचलन को समायोजित कर सकते हैं।

NA> 0.95 लक्ष्यों के लिए गैर-फ्लोरोसेंट, पीसीबी मुक्त विसर्जन तेल (η=1.515) का प्रयोग करें। बुलबुला मुक्त आवेदन इष्टतम प्रदर्शन सुनिश्चित करता है।