현미경 탐사에서 연구자들은 종종 좌절스러운 한계에 직면합니다. 최대 확대에서도 미세한 샘플 세부 사항은 불분명합니다.이 과제는 부적절한 확대로 인한 것이 아니라 광 현미경의 두 가지 핵심 매개 변수인 수치 개도 (NA) 와 해상도의 근본적인 제약으로 인해 발생합니다.이 기사 는 이 중요 한 요인 들 사이의 관계 를 조사 하고 현미경 성능 을 극대화 하기 위한 실용적 전략 을 제시 한다.
수치열개는 객체 렌즈의 빛을 수집하고 미세한 표본 세부 사항을 해상하는 능력을 정량화하며, 작업 거리와 직접 관련됩니다.빛이 표본을 통과하고 객체에 들어갈 때, 그것은 뒤집어진 피침형 빔을 형성합니다.
가시광선은 400-700nm 사이의 파장의 전자기파를 포함한다. 참고로, 녹색광은 550nm (0.55μm) 주위를 중심으로 한다. 현미경 표본을 조명할 때,빛의 분광은 원래 경로에서 벗어날 수 있습니다.더 작은 표본은 더 두드러진 분광을 발생시킨다. 더 높은 NA 객체들은 더 급각에서 빛을 포착하여 더 세밀한 구조를 관찰할 수 있다.
병렬 조명을 사용하는 기본 현미경 시스템 (공체체 없이) 은 제한된 피침각 내에서 빛을 수집한다.콘덴서 를 추가 하면, 빛 수집 각과 일치 하는 조명 콘이 만들어집니다., 커진 작업 개도 (원인과 응축기의 개도 각의 합) 를 통해 시스템 해상도를 극대화합니다.
NA는 다음과 같이 정의됩니다.
NA = η • sin ((α)
여기서 α는 렌즈의 오프레이션 각의 절반을 나타내고 η는 렌즈와 커버 슬립 사이의 몰입 매체의 굴절 지수를 나타냅니다 (η = 1 공기; 1.51 오일/글라스).
sin ((α) 는 1을 초과할 수 없기 때문에 (90°에서 이론적 최대), 실용적인 NA 값은 몰입 매체에 크게 의존합니다. 고성능 객체는 일반적으로 70-80° 수집 각도를 달성합니다.NA=1을 초과하기 위해 오일 침몰을 필요로 합니다..0.
현미경 해상도는 두 샘플 포인트가 구별되는 최소 분리를 정의합니다. 이 분광 제한 속성은 객체에 들어가는 빛 파동 각에 달려 있습니다.초점이 인식된 세부 사항에 영향을 미치는 높은 확대에서 해상도를 다소 주관적으로 만드는.
확대하면 이미지의 물리적인 해상도를 초과하면 새로운 세부 사항을 드러내지 않고 "공백 확대"가 발생합니다.최적의 확대량은 일반적으로 객체의 NA 값의 500-1000 배 사이입니다..
60-100 × 객체 사이의 몰입 오일 (η = 1.51) 을 사용하면 공기 유리 굴절 인터페이스를 제거하여 빛 손실을 최소화하고 NA를 극대화합니다.거품이 없는 적절한 적용은 중요합니다. 거품은 객체의 후방 초점 평면을 검사함으로써 검출 할 수 있습니다..
현미경 광학은 동심 고리들로 둘러싸인 에어리 디스크의 분사 패턴으로 표본 포인트를 표현합니다. 최소 해소 가능한 거리 (d0이 두 가지 패턴의 간격은 실질적인 해상도를 정의합니다.
에른스트 애베의 방정식은 해상도 한도를 정의합니다.
측면 해상도 (x,y) = λ / 2NA
축 해상도 (z) = 2λ / NA2
λ=400 nm에서 NA=1.40의 경우, 이것은 ~150 nm 측면 및 ~400 nm 축적 해상도 한도를 제공합니다.
두 개의 에어리 디스크가 중심 최대가 서로의 첫 번째 최소와 정렬될 때까지 (피크 사이의 20% 강도 하락) 접근하면 다음과 같이 설명된 해상성 문턱에 도달합니다.
d0= 1.22λ / (NA)대상+ NA조건)
건조한 객체에 있는 지문이나 침수 렌즈에 있는 오염은 빛을 산란시키고, 대조를 감소시킵니다. 렌즈 등급의 에탄올과 털 없는 천으로 청소합니다.
높은 NA (>0.65) 의 목표는 170 μm 커버 슬립을 필요로합니다. 반면 목표는 NA> 0에서 ~ 10 μm 변형을 견딜 수 있습니다.7, 낮은 NA 렌즈는 30μm의 오차를 수용할 수 있습니다.
NA> 0.95 목표를 위해 비 형광, PCB 없는 몰입 기름 (η=1.515) 을 사용하십시오. 거품 없는 적용은 최적의 성능을 보장합니다.
