ในการสํารวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ นักวิจัยมักต้องเผชิญกับข้อจํากัดที่ทําให้ประสาทเสียใจ แม้จะขยายขนาดสูงสุด แต่รายละเอียดตัวอย่างละเอียดยังคงไม่ชัดเจนความท้าทายนี้ไม่ได้มาจากการขยายขนาดที่ไม่เพียงพอ แต่มาจากข้อจํากัดพื้นฐานที่นํามาโดยปารามิตรหลักสองตัวของกล้องจุลินทรีย์แสงบทความนี ้ ตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างปัจจัยสําคัญเหล่านี้และนําเสนอกลยุทธ์ที่ใช้ในการยกระดับการทํางานของกล้องจุลทรรศน์สูงสุด.
อพาร์ทเม้นต์จํานวนจะระบุความสามารถของเลนส์วัตถุประสงค์ในการรวบรวมแสงและแก้ไขรายละเอียดตัวอย่างละเอียด โดยตรงกับระยะทางการทํางานของมันเมื่อแสงผ่านตัวอย่างและเข้าไปในเป้าหมาย, มันสร้างรั้วทรงโคลนกลับ
แสงที่มองเห็นได้ประกอบด้วยคลื่นไฟฟ้าแม่เหล็กที่มีความยาวคลื่นระหว่าง 400-700 นม. สําหรับการอ้างอิง, แสงสีเขียวศูนย์กลางรอบ 550 นม (0.55 μm).การสับสนของแสง ทําให้เบี่ยงเบนจากเส้นทางเดิมตัวอย่างขนาดเล็ก ๆ สร้างการสับสนที่ชัดเจนขึ้น จุดประสงค์ NA ที่สูงกว่าจะจับแสงในมุมที่คึกคักมากขึ้น ทําให้สามารถสังเกตโครงสร้างที่ละเอียดมากขึ้น
ระบบกล้องจุลินทรีย์พื้นฐานที่ใช้แสงคู่เคียง (โดยไม่ใช้เครื่องประปา) เก็บแสงภายในมุมโขนจํากัดการเพิ่มเครื่องปรับความหนาจะสร้างขั้วแสงที่ตรงกับมุมการเก็บแสงของเป้าหมาย, เพิ่มความละเอียดของระบบสูงสุดโดยการเพิ่มช่องเปิดการทํางาน
NA ได้กําหนดว่า
NA = η • sin ((α)
โดยที่ α เป็นมุมเปิดของเลนส์ครึ่งหนึ่ง และ η เป็นอัตราการหดของสื่อการดําน้ําระหว่างเลนส์และคลื่นปกปิด (η = 1 สําหรับอากาศ; 1.51 สําหรับน้ํามัน/กระจก)
เนื่องจาก sin ((α) ไม่สามารถเกิน 1 (ทฤษฎีสูงสุดที่ 90 °) ค่านิยม NA ที่ใช้ได้ขึ้นอยู่กับสื่อการดําน้ํามาก.จําเป็นต้องดําน้ํามันเกิน NA=1.0.
ความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์กําหนดความแยกที่ต่ําสุดเมื่อจุดตัวอย่างสองจุดปรากฏที่แตกต่างกัน คุณสมบัติจํากัดการสับสนนี้ขึ้นอยู่กับมุมคลื่นแสงที่เข้าสู่เป้าหมายทําให้ความละเอียดเป็นเรื่องของตัวประชากรในภาพที่เลิศสูง โดยที่การโฟกัสจะส่งผลต่อความละเอียด.
เมื่อการเลื่อนขนาดเกินความสามารถในการแก้ไขภาพของภาพ "การเลื่อนขนาดเปล่า" เกิดขึ้นโดยไม่เปิดเผยรายละเอียดใหม่การขยายที่ดีที่สุดโดยทั่วไปจะอยู่ในช่วง 500-1000 เท่าของค่า NA ของเป้าหมาย.
การใช้น้ํามันดําน้ํา (η = 1.51) ระหว่างเป้าหมาย 60-100 × ทําให้กําจัดการผูกพันการสลายอากาศ-กระจก, ลดความสูญเสียแสงให้น้อยที่สุดและยกระดับ NA.การใช้งานที่เหมาะสมโดยไม่ต้องมีฟองเป็นสิ่งสําคัญ กล่องสามารถตรวจพบได้โดยการตรวจสอบระดับจุดเฉพาะด้านหลังของเป้าหมาย.
มิกรอสโคปออปติกส์แสดงจุดตัวอย่างเป็นแผ่น Airy กลมกระจายแสง รอบล้อมโดยวงแหวน0) ระหว่างสองรูปแบบดังกล่าวกําหนดการแก้ไขเชิงปฏิบัติการ
สมการของเอิร์นสต์ แอบเบ้ กําหนดขีดจํากัดความละเอียด
ความละเอียดด้านข้าง (x,y) = λ / 2NA
ความละเอียดของแกน (z) = 2λ / NA2
สําหรับ NA=1.40 ที่ λ=400 nm, นี้ผลิต ~ 150 nm ทิศทางและ ~ 400 nm ทิศแกนความละเอียดขีดจํากัด
เมื่อสองแผ่น Airy ใกล้ชิดจนถึงจุดสูงสุดกลางของพวกเขาตรงกับจุดต่ําสุดแรกของกันและกัน (20% ความเข้มข้นลดระหว่างจุดสูงสุด) พวกเขาจะบรรลุขั้นต่ําความละเอียดที่อธิบายโดย:
d0= 1.22λ / (NAปัจจัย+ NAสภาพ)
รอยนิ้วมือบนเป้าหมายแห้ง หรือปนเปื้อนบนเลนส์ดําน้ํา จะกระจายแสง ลดความแตกต่าง ทําความสะอาดด้วยเอธานอลเกรดเลนส์ และผ้าที่ไม่มีขน
เป้าหมาย NA สูง (> 0.65) จําเป็นต้องใช้คลุม 170 μm ในขณะที่เป้าหมายทนความแตกต่างของ ~ 10 μm ใน NA> 0.7, เลนส์ NA ต่ํากว่าอาจรองรับการเบี่ยงเบน 30 μm
ใช้น้ํามันลึกลงที่ไม่หลั่งแสง ไม่มี PCB (η = 1.515) สําหรับเป้าหมาย NA> 0.95 การใช้ฟองฟองไม่ให้ผลงานได้ดีที่สุด
