Trong nghiên cứu bằng kính hiển vi, các nhà nghiên cứu thường phải đối mặt với một hạn chế đáng thất vọng: ngay cả khi phóng to tối đa, các chi tiết mẫu mịn vẫn không rõ ràng.Thách thức này không xuất phát từ sự phóng to không đủ mà từ những hạn chế cơ bản do hai thông số cốt lõi của kính hiển vi quang họcBài viết này xem xét mối quan hệ giữa các yếu tố quan trọng này và trình bày các chiến lược thực tế để tối đa hóa hiệu suất kính hiển vi.
Mở quang số đo lường khả năng thu thập ánh sáng và giải quyết các chi tiết mẫu vật mịn của ống kính, tương quan trực tiếp với khoảng cách làm việc của nó.Khi ánh sáng đi qua một mẫu và đi vào mục tiêu, nó tạo thành một chùm hình nón đảo ngược.
Ánh sáng nhìn thấy được bao gồm sóng điện từ với bước sóng từ 400-700 nm. Để tham khảo, ánh sáng xanh tập trung khoảng 550 nm (0,55 μm). Khi chiếu sáng các mẫu kính hiển vi,Phân xạ ánh sáng gây ra sự lệch từ đường đi ban đầu của nóCác mẫu nhỏ hơn tạo ra nhiễu xạ rõ rệt hơn. Các ống kính NA cao hơn thu ánh sáng ở góc dốc hơn, cho phép quan sát các cấu trúc tinh tế hơn.
Các hệ thống kính hiển vi cơ bản sử dụng ánh sáng song song (không có chất tụ) thu thập ánh sáng trong một góc nón hạn chế.Thêm một chất ngưng tụ tạo ra nón chiếu sáng phù hợp với góc thu ánh sáng của ống kính, tối đa hóa độ phân giải hệ thống thông qua tăng khẩu độ làm việc
NA được định nghĩa là:
NA = η • sin ((α)
Trong đó α đại diện cho một nửa góc khẩu độ của ống kính, và η biểu thị chỉ số khúc xạ của môi trường ngâm giữa ống kính và ván nắp (η = 1 cho không khí; 1,51 cho dầu / thủy tinh).
Vì sin ((α) không thể vượt quá 1 (tối đa lý thuyết ở 90 °), các giá trị NA thực tế phụ thuộc rất nhiều vào môi trường ngâm.yêu cầu ngâm dầu vượt quá NA=1.0.
Độ phân giải kính hiển vi xác định độ phân cách tối thiểu khi hai điểm mẫu xuất hiện khác nhau.làm cho độ phân giải có phần chủ quan ở độ phóng to cao nơi tập trung ảnh hưởng đến chi tiết nhận thức.
Khi phóng to vượt quá khả năng phân giải vật lý của một hình ảnh, "sự phóng to trống" xảy ra mà không tiết lộ chi tiết mới.Lượng phóng to tối ưu thường nằm trong khoảng 500-1000 lần giá trị NA của ống kính.
Sử dụng dầu ngâm (η = 1,51) giữa các mục tiêu 60-100x loại bỏ giao diện khúc xạ khí-thanh, giảm thiểu mất ánh sáng và tối đa hóa NA.Ứng dụng đúng cách mà không có bong bóng là rất quan trọng bong bóng có thể được phát hiện bằng cách kiểm tra mặt phẳng tiêu cự phía sau của ống kính.
Kính kính hiển vi quang học hiển thị các điểm mẫu như đĩa Airy được bao quanh bởi vòng đồng tâm.0) giữa hai mô hình như vậy xác định giải pháp thực tế.
Các phương trình của Ernst Abbe xác định giới hạn độ phân giải:
Độ phân giải bên (x,y) = λ / 2NA
Độ phân giải trục (z) = 2λ / NA2
Đối với NA = 1,40, ở λ = 400 nm, điều này mang lại giới hạn độ phân giải bên cạnh ~ 150 nm và giới hạn độ phân giải trục ~ 400 nm.
Khi hai đĩa Airy tiếp cận cho đến khi tối đa trung tâm của chúng thẳng hàng với mức tối thiểu đầu tiên của nhau (20% giảm cường độ giữa các đỉnh), chúng đạt đến ngưỡng giải quyết được mô tả bởi:
d0= 1,22λ / (NA)Mục đích+ NAĐiều kiện)
Dấu vân tay trên các mục tiêu khô hoặc ô nhiễm trên ống kính ngâm sẽ làm phân tán ánh sáng, làm giảm độ tương phản.
Các mục tiêu NA cao (> 0,65) đòi hỏi 170 μm cover slip. Trong khi các mục tiêu dung nạp ~ 10 μm biến đổi ở NA> 0.7, ống kính NA thấp hơn có thể chứa các độ lệch 30 μm.
Sử dụng dầu ngâm không huỳnh quang, không có PCB (η = 1,515) cho các mục tiêu NA> 0,95.
