Naukowcy zwiększają rozdzielczość mikroskopową dzięki opanowaniu apertury numerycznej

W badaniach mikroskopowych badacze często napotykają frustrujące ograniczenie: nawet przy maksymalnym powiększeniu drobne szczegóły próbki pozostają niewyraźne.Wyzwanie to wynika nie z niewystarczającego powiększania, ale z podstawowych ograniczeń nałożonych przez dwa podstawowe parametry mikroskopii optycznejW tym artykule analizowany jest związek między tymi kluczowymi czynnikami i przedstawione praktyczne strategie maksymalizacji wydajności mikroskopu.

Numeryczna przysłona ilościowo określa zdolność obiektywu do zbierania światła i rozstrzygania drobnych szczegółów próbki, bezpośrednio korelując z jej odległością roboczą.Kiedy światło przechodzi przez próbkę i wchodzi do obiektywu, tworzy odwrócony stożkowy wiązek.

Światło widzialne składa się z fal elektromagnetycznych o długości fali od 400 do 700 nm. Dla odniesienia zielone światło koncentruje się wokół 550 nm (0,55 μm).Dyfrakcja światła powoduje odchylenie się od oryginalnej trasyWiększe obiektywy NA wychwytują światło pod bardziej stromymi kątami, umożliwiając obserwację subtelniejszych struktur.

Podstawowe systemy mikroskopu wykorzystujące równoległe oświetlenie (bez kondensatorów) zbierają światło w ograniczonym kącie stożka.Dodanie kondensatora tworzy stożki oświetlenia, które pasują do kąta zbierania światła obiektywu, maksymalnie zwiększając rozdzielczość systemu poprzez zwiększenie apertury roboczej, sumę kątów apertury obiektywu i kondensatora.

NA jest zdefiniowany jako:

NA = η • sin ((α)

gdzie α oznacza połowę kąta przysłony obiektywu, a η wskazuje wskaźnik załamania środka zanurzenia pomiędzy soczewką a okładką (η = 1 dla powietrza; 1,51 dla oleju/szkła).

Ponieważ sin ((α) nie może przekroczyć 1 (maksymalny teoretyczny w 90°), praktyczne wartości NA w dużym stopniu zależą od nośników zanurzania.wymagające zanurzenia w oleju do przekroczenia NA=1.0.

Rozdzielczość mikroskopu określa minimalne oddzielenie, w którym dwa punkty próbki wydają się odrębne.powodując, że rozdzielczość jest nieco subiektywna przy dużych powiększeniach, gdzie skupienie wpływa na postrzegane szczegóły.

Kiedy powiększenie przekracza zdjęcie o fizycznej rozdzielczości, występuje "puste powiększenie" bez ujawniania nowych szczegółów.Optymalne powiększenie zazwyczaj wynosi od 500 do 1000 razy więcej niż wartość NA obiektywu.

Wykorzystanie oleju zanurzającego (η = 1,51) między obiektywami 60-100x eliminuje rozbiórcze interfejsy powietrza-szkła, minimalizując straty światła i maksymalizując NA.Prawidłowe stosowanie bez pęcherzyków ma kluczowe znaczenie. Pęcherzyki można wykryć, badając tylną płaszczyznę ogniskową obiektu..

Mikroskop optyczny oddaje punkty próbki jako dyski powietrzne, otoczone koncentrycznymi pierścieniami.₀) między dwoma takimi wzorcami definiuje praktyczną rozwiązanie.

Równania Ernsta Abbe'a określają granice rozdzielczości:

Rozdzielczość boczna (x, y) = λ / 2NA

Rozdzielczość osiowa (z) = 2λ / NA²

W przypadku NA=1,40 przy λ=400 nm daje to ~150 nm bocznych i ~400 nm ośnych limitów rozdzielczości.

Kiedy dwa dyski Airy zbliżają się do siebie, aż ich centralne maksymum wyrównują się z pierwszymi minimum siebie (20% spadku intensywności między szczytami), osiągają one próg rozdzielczości opisany przez:

d₀= 1,22λ / (NA)_Celem+ NA_Warunki)

Odciski palców na suchych obiektach lub zanieczyszczenia na soczewkach zanurzających rozpraszają światło, zmniejszając kontrast.

Cele o wysokim NA (>0,65) wymagają 170 μm przekładni, podczas gdy cele tolerują ~10 μm zmienności przy NA>0.7, soczewki o niższej NA mogą pomieścić 30 μm odchyleń.

W celu osiągnięcia celów NA> 0,95 należy stosować olej zanurzający niefluorescencyjny, wolny od PCB (η=1,515).