Gli scienziati avanzano la risoluzione microscopica con la padronanza dell'apertura numerica

Nell'esplorazione al microscopio, i ricercatori si trovano spesso di fronte a una limitazione frustrante: anche con l'ingrandimento massimo, i dettagli del campione restano indistinti.Questa sfida non deriva da un ingrandimento insufficiente, ma da vincoli fondamentali imposti da due parametri fondamentali della microscopia ottica: apertura numerica (NA) e risoluzioneQuesto articolo esamina la relazione tra questi fattori critici e presenta strategie pratiche per massimizzare le prestazioni del microscopio.

L'apertura numerica quantifica la capacità di una lente oggettiva di raccogliere luce e risolvere dettagli di campioni sottili, in correlazione diretta con la sua distanza di lavoro.Quando la luce passa attraverso un campione e entra nell'obiettivo, forma una trave conica invertita.

La luce visibile comprende onde elettromagnetiche con lunghezze d'onda comprese tra 400-700 nm. Per riferimento, la luce verde si concentra intorno ai 550 nm (0,55 μm).La diffrazione della luce provoca una deviazione dal suo percorso originaleGli obiettivi NA più alti catturano la luce ad angoli più ripidi, consentendo l'osservazione di strutture più fini.

I sistemi di microscopio di base che utilizzano illuminazione parallela (senza condensatori) raccolgono luce all'interno di un angolo di cono limitato.L'aggiunta di un condensatore crea coni di illuminazione che corrispondono all'angolo di raccolta della luce dell'obiettivo, massimizzando la risoluzione del sistema attraverso un aumento dell'apertura di lavoro, la somma degli angoli di apertura dell'oggetto e del condensatore.

NA è definito come:

NA = η • sin ((α)

In cui α rappresenta la metà dell'angolo di apertura dell'obiettivo e η indica l'indice di rifrazione del mezzo di immersione tra l'obiettivo e il rivestimento (η = 1 per l'aria; 1,51 per l'olio/vetro).

Dato che il sin ((α) non può superare 1 (massimo teorico a 90°), i valori pratici di NA dipendono fortemente dai mezzi di immersione.che richiedono l'immersione in olio per superare NA=1.0.

La risoluzione del microscopio definisce la separazione minima in cui due punti del campione appaiono distinti.rendendo la risoluzione un po'soggettiva ad alti ingrandimenti in cui il fuoco influenza i dettagli percepiti.

Quando l'ingrandimento supera la capacità di risoluzione fisica di un'immagine, si verifica "ingrandimento vuoto" senza rivelare nuovi dettagli.L'ingrandimento ottimale è generalmente compreso tra 500-1000 volte il valore NA dell'obiettivo.

L'utilizzo di olio di immersione (η=1.51) tra obiettivi da 60-100 volte elimina le interfacce di rifrazione aria-vetro, riducendo al minimo la perdita di luce e massimizzando il NA.L'applicazione corretta senza bolle è fondamentale. Le bolle possono essere rilevate esaminando il piano focale posteriore dell'obiettivo..

L'ottica al microscopio rende i punti del campione come dischi di Airy – modelli di diffrazione circondati da anelli concentrici.₀) definisce la risoluzione pratica tra due di questi modelli.

Le equazioni di Ernst Abbe definiscono i limiti di risoluzione:

Risoluzione laterale (x,y) = λ / 2NA

Risoluzione assiale (z) = 2λ / NA²

Per NA=1,40 a λ=400 nm, questo produce limiti di risoluzione laterali di ~150 nm e assiali di ~400 nm.

Quando due dischi di Airy si avvicinano fino a quando i loro massimi centrali si allineano con i primi minimi l'uno dell'altro (20% di calo di intensità tra i picchi), raggiungono la soglia di risoluzione descritta da:

d₀= 1,22λ / (NA)_Oggetto+ NA_Condizione)

Impronte digitali su obiettivi asciutti o contaminazione sulle lenti a immersione disperdono la luce, riducendo il contrasto.

Gli obiettivi ad alta NA (> 0,65) richiedono 170 μm di coperture.7, le lenti a NA inferiore possono ospitare deviazioni di 30 μm.

Utilizzare olio di immersione non fluorescente e privo di PCB (η=1,515) per obiettivi NA> 0,95.